Differentially Expressed Genes in Prostate Cancer

Abstract

Eturauhassyöpä, kuten muutkin syövät, aiheutuu solun DNA-muutoksista, joiden seurauksena osa geeneistä yliaktivoituu ja osa lakkaa kokonaan toimimasta. Syövän synnyn kannalta merkittävimpiä ovat muutokset ns. kasvurajoitegeenien ja syöpägeenien toiminnassa. Solu voi menettää kasvurajoitegeenin toiminnan esimerkiksi mutaation tai kromosomialueen häviämän seurauksena. Vastaavasti kromosomialueiden monistumat voivat johtaa alueella sijaitsevien syöpägeenien ilmentymisen lisääntymiseen. Näiden muutosten seurauksena solu saa kasvuedun ja alkaa lisääntyä normaalisoluja nopeammin.

Eturauhassyöville tyypilliset kromosomien häviämä- ja monistuma-alueet on tähän mennessä kuvattu jo varsin hyvin. Toistaiseksi näiltä kromosomialueilta on kuitenkin kyetty tunnistamaan vain hyvin vähän sellaisia kasvurajoitegeenejä tai syöpägeenejä, joiden muutokset voisivat olla selittävänä tekijänä merkittävässä osassa eturauhassyöpätapauksista.

Häviämien ja monistumien kohdegeenejä voidaan etsiä paitsi tutkimalla itse kromosomialueita, myös epäsuorasti havainnoimalla eroja geenien aktiivisuudessa eli ilmentymisessä. Tämän työn tarkoituksena oli tunnistaa sellaisia geenejä, joiden ilmentyminen etutauhassyövässä on muuttunut. Tätä tarkoitusta varten yhdistettiin kaksi uutta molekyylibiologista menetelmää, suppressiosubtraktiohybridisaatio (SSH) ja DNA-mikrosiruhybridisaatio, joiden soveltuvuutta ja luotettavuutta testattiin ensimmäisessä osatyössä selvittämällä subtraktion tehokkuus sekä siruhybridisaation herkkyys ja lineaarisuus. Tämän jälkeen näitä menetelmiä käyttäen seulottiin sellaisia geenejä, joiden ilmentyminen eturauhassyöpäsoluissa oli joko heikentynyt tai lisääntynyt. Ilmentymismuutosten tutkimisessa hyödynnettiin lisäksi myös kaupallisia mikrosiruja.

Toisessa osatyössä SSH- ja mikrosirutekniikoiden yhdistelmällä tunnistettiin kaksi geeniä, RAD21 ja KIAA0196, joiden ilmentyminen oli lisääntynyt eturauhassyövässä ja jotka olivat myös monistuneet 30-40%:ssa pitkälle edenneistä eturauhassyövistä. Kolmannessa osatyössä havaittiin elongin C-geenin ilmentymisen lisääntyminen eturauhassyövissä. Elongin C-geenin monistumia todettiin n. 20%:ssa pitkälle edenneistä syövistä. Edellä kuvatut tulokset viittaavat siihen, että RAD21-, KIAA0196- ja elongin C -geenit saattavat olla osallisina eturauhassyövän etenemisessä.

SSH- ja sirutekniikoiden avulla löydettiin myös yksi tuntematon geeni, STEAP2, jonka ominaisuuksia tutkittiin neljännessä osatyössä. STEAP2-geenin karakterisointi paljasti sen, että ko. geenin koodaama proteiini sijaitsee solussa enimmäkseen ulkokalvolla, mutta myös solulimassa olevissa jyvämäisissä rakenteissa. Lisäksi havaittiin, että STEAP2-geenin ilmentyminen eturauhassyöpäsoluissa on lisääntynyt. STEAP2:n tehtävä solussa on toistaiseksi selvittämättä, mutta solukalvolla sijaitsevana proteiinina sitä voisi olla mahdollista hyödyntää uusien eturauhassyövän diagnostiikka- ja hoitomenetelmien kehittelyssä.

STEAP2:a läheisesti muistuttavan "sukulaisgeenin", pHyde:n, on aiemmin julkaistuissa tutkimuksissa osoitettu hillitsevän eturauhassyöpäsolujen jakautumista ja kykyä muodostaa kasvaimia. Viidennessä osatyössä tutkittiin, täyttääkö pHyde-geeni eturauhassyövässä ns. klassisen kasvurajoitegeenin määritelmät, eli ovatko geenin molemmat kopiot syöpäsoluissa yleisesti vaurioituneet joko geenin mutaation tai häviämän seurauksena. Koska tutkituista eturauhassyöpänäytteistä löytyi vain hyvin vähän pHyde-geenin mutaatioita ja häviämiä, ja koska myöskään pHyde-geenin ilmentymismuutoksia ei havaittu, on epätodennäköistä että pHyde-geeni olisi eturauhassyövän kasvurajoitegeeni.

Yhteenvetona tutkimuksessa tunnistettiin neljä sellaista geeniä (RAD21, KIAA0196, elongin C ja STEAP2), jotka mahdollisesti liittyvät eturauhassyövän kehittymiseen. Koska näitä geenejä ei ole aikaisemmin kuvattu syövän yhteydessä, jatkotutkimusten tavoitteena on pyrkiä selvittämään se, miten ne voisivat olla osallisina syövän syntymisessä ja etenemisessä.

DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES IN PROSTATE CANCER

To identify genes that could be involved in the development of prostate cancer, a combination of suppression subtractive (SSH) and cDNA microarray hybridizations was used for the detection of differentially expressed genes. Both methods were first validated by studying the efficiency of the subtraction as well as the sensitivity and the linearity of the array hybridization. Two subtracted cDNA libraries were constructed using a prostate cancer cell line PC-3 as a model for cancer and benign prostatic hyperplasia (BPH) tissue as a non-cancerous model, and subsequently screened for differentially expressed genes by cDNA microarray hybridization.

Using SSH and cDNA microarray hybridization, RAD21 and KIAA0196 genes were found to be overexpressed in PC-3. In the real-time quantitative RT-PCR analysis, RAD21 and KIAA0196 also showed elevated expression in clinical prostate carcinomas. Using fluorescence in situ hybridization analysis (FISH), amplifications of the RAD21 and the KIAA0196 genes were detected in 30-40% of hormone-refractory prostate cancers. Overexpression of elongin C gene, located in 8q21, was detected by utilizing commercial cDNA microarray slides and the PC-3 cell line containing amplification of the 8q region. In FISH analysis, amplifications of the elongin C gene were detected in about 20% of hormone-refractory tumors. Expression of elongin C was also increased in hormone-refractory tumors according to the real-time quantitative RT-PCR analysis. In conclusion, KIAA0196, RAD21, and elongin C are putative target genes for the common amplification of 8q in prostate cancer.

An anonymous EST, expressed in BPH but not in PC-3, was detected using a combination of the SSH and array hybridization methods. Full-length cloning of this EST revealed a novel gene, designated as STEAP2, which encodes for a putative six-transmembrane protein. Using a green fluorescent protein (GFP) fusion construct, it was demonstrated that STEAP2 protein is located mainly in the plasma membrane, as well as in vesicle-like structures in the cytoplasm. STEAP2 was shown to be predominantly expressed in prostate epithelial cells, and the expression is increased in prostate carcinoma cells. The biological function of STEAP2 is still unknown, but as a cell-surface antigen, STEAP2 is a potential diagnostic or therapeutic target in prostate cancer.

One of the closest homologs of the STEAP2 protein is a rat protein pHyde. Rat pHyde has been reported to display tumor suppressive activities in human prostate cancer cells. To study whether human pHyde is a classical tumor suppressor gene in prostate cancer, xenograft and clinical prostate carcinoma samples were screened for pHyde mutations using DHPLC analysis as well as sequencing. In addition, gene copy numbers of pHyde were analyzed by FISH. Of the 68 samples analyzed, only two (3%) contained mutations in the pHyde gene suggesting that biallelic inactivation of pHyde is a rare event and that pHyde is not a classical tumor suppressor in prostate cancer.