Regulation of STAT6-mediated transcription in IL-4-induced signal transduction

Abstract

Sytokiinit ovat liukoisia välittäjäaineita, jotka säätelevät immuunijärjestelmän solujen erilaistumista, kasvua ja toimintaa. Sytokiinin sitoutuminen solukalvolla ilmentyvään reseptoriinsa saa aikaan solun sisäisten signalointireittien aktivaation, ja tämä johtaa lopulta muutoksiin solun biologiassa.

Tutkimuksen kohteena on sytokiini interleukiini (IL) ­4:n aktivoiman geenivasteen säätelymekanismit. IL-4 on keskeinen vasta-ainevälitteisen immuniteetin säätelijä, ja sen tiedetään käynnistävän allergisia reaktiota välittävän IgE:n tuotannon B-soluissa. IL-4:n sitoutuminen reseptoriinsa johtaa STAT6-transkriptiotekijän aktivaatioon JAK-tyrosiinikinaasien välityksellä. Aktivoitu STAT6 siirtyy tumaan, jossa se sitoutuu IL-4-responsiivisten geenien (mm. Ige, CD23, MHC II) säätelyalueelle käynnistäen näiden transkription. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää STAT6:n säätelymekanismeja, sekä tutkia STAT6:n toimintaa Ige-geenin promoottoriaktivaatiossa.

STAT6:n tyrosiinifosforylaation tiedetään olevan välttämätön IL-4-responsiivisten geenien transkriptiossa. Tutkimuksessa osoitettiin ensimmäistä kertaa IL-4:n aikaansaavan B-soluissa myös STAT6:n seriinifosforylaation lisääntymisen. Seriini/treoniinikinaasiaktivisuuden osoitettiin lisäksi olevan välttämätön IL-4/STAT6-välitteisessä geenivasteessa. Kyetäkseen tehokkaasti aktivoimaan Ige-geenin transkription, ja siten IgE-vasta-ainetuotannon B-soluissa, IL-4 tarvitsee apua CD40-pinta-antigeenin kautta aktivoituvilta signalointimolekyyleiltä. CD40:n aktivoiman p38 MAP -seriini/treoniinikinaasin havaittiin voimistavan IL-4:n geenivasteita lisäämällä suoraan STAT6:n transaktivaatiopotentiaalia.

Jatkotutkimuksena pyrittiin identifioimaan uusia STAT6:n kanssa interaktoivia proteiineja. Kofaktori p100:n on aikaisemmin osoitettu säätelevän Epstein-Barrviruksen tuma-antigeeni 2:n (EBNA2) välittämiä geenivasteita. p100:n osoitettiin assosioituvan suoraan STAT6:n transkriptiota aktivoivan osan kanssa lisäten IL-4:n indusoimaa Ige-promoottoriaktivaatiota. STAT6:n sitoutumiskohdan Ige-promoottorilla (Ige -STAT6RE) havaittiin olevan solutyyppispesifisesti säädelty. Ige -STAT6RE:n osoitettiin sisältävän sitoutumissekvenssin hematopoieettisissa soluissa ilmentyvälle PU.1-transkriptiotekijälle. PU.1-proteiinin ilmentäminen transfektion avulla sai aikaan Ige -STAT6RE-välitteisen transkription aktivoitumisen myös ei-hematopoieettisissa soluissa.

IL-4:llä tiedetään olevan keskeinen osuus atooppisten tautien patogeneesissä, ja IL-4/STAT6-signalointireitti on siten yksi mahdollisista allergia- ja astmalääkkeiden kohteista. Tutkimus on tuottanut uutta tietoa STAT6:n toiminnasta luoden täten edellytyksiä tulevaisuuden lääkekehitystyölle.

Cytokines are a group of small, secreted glycoproteins that have a crucial role in the regulation of cellular events including proliferation and differentiation. Hydrophilic cytokines cannot penetrate through the cell membrane; instead they bind transmembrane receptor molecules that consequently trigger intracellular signaling pathways. Pleiotropic cytokine IL-4 serves as a critical mediator of humoral immune responses executed by B and Th2 type lymphocytes. The engagement of IL-4 receptor on the cell surface leads to the activation of JAK1 and JAK3 tyrosine kinases followed by tyrosine phosphorylation and dimerization of transcription factor STAT6. The activated STAT6 translocates to the nucleus where it binds to specific DNA elements and activates the transcription of IL-4 responsive genes such as IL-4Ra, CD23, MHC class II molecules, and germline Ige. The immediate signaling events that lead to the activation and DNA binding of STAT6 are well established, but relatively little is known about the molecular mechanisms of STAT6-mediated transcription and the regulation of STAT6 activity. The aim of this study was to evaluate the role of serine/threonine kinase activity in STAT6-mediated signaling and the cofactor requirements of STAT6 in Ige promoter activation. It was observed that IL-4 stimulation induced the phosphorylation of STAT6 on both serine and tyrosine residues in B cells, and STAT6-mediated gene activation was dependent on serine/threonine inhibitor H7-sensitive kinase activity. The serine phosphorylation of STAT6 was insensitive to H7 treatment, instead H7 downregulated the IL-4-induced phosphorylation of RNA polymerase II. CD40 antigen engagement provides an important costimulatory signal for IL-4 treatment by activating many intracellular signaling molecules, including p38 MAP kinase. p38 MAP kinase activity was found to enhance the STAT6 transactivation domain (TAD)-driven transcription without an effect on the immediate activation or phosphorylation events of STAT6. The transcriptional coactivat or p100 was identified as a novel STAT6TAD interacting protein. p100 expression did not affect the immediate activation events of STAT6, but it enhanced IL-4-induced germline Ige gene transcription in B cells. The results from interaction studies suggested that p100 functions as a bridging factor between STAT6 and the basal transcription machinery. The STAT6 response element in Ige promoter was observed to be activated in a cell-type specific manner. A minimal low affinity core binding sequence for hematopoietic transcription factor PU.1 was identified within the Ige-STAT6 DNA-binding site. PU.1 restored the IL-4-inducibility of Ige-STAT6 response element in non-hematopoietic cells. The co-operation between PU.1 and STAT6 in the transactivation of the Ige gene represents a molecular mechanism for the fine-tuning of the cell-type restricted expression of IL-4-induced gene responses.