Developmental expression of transcription factors

Abstract

Transkriptiofaktoreiden ohjaama geenien luenta säätelee sikiökehitystä

Geenit ohjaavat monimutkaista kehitystapahtumaa, jonka aikana solut jakautuvat kasvun mahdollistamiseksi, erilaistuvat ja ohjautuvat kolmiulotteisesti muodostamaan elimiä. Kaikki geenit eivät ole aktiivisia samaan aikaan, vaan niitä luetaan tiettyinä ajankohtina, jotta kehitystapahtuma etenisi johdonmukaisesti. Geenien luentaa säätelevillä proteiineilla, transkriptiofaktoreilla, on keskeinen rooli kehityksen säätelijöinä.

Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin in situ hybridisaatio-tekniikkaa ja immunohistokemiallisia menetelmiä käyttäen kuuden geenien luentaa säätelevän valkuaisaineen ilmentymistä hiiren ja rotan sikiökehityksen aikana. Tutkimuksen kohteena olivat ns. Fox-proteiinit Foxf1, Foxf2 ja Foxe3, dioksiinireseptorin kuljetusproteiinit Arnt ja Arnt2, sekä Arntin kanssa sitoutuva Tacc3. Kaikki tutkitut proteiinit ilmentyivät ajallisesti ja paikallisesti tarkkaan säädeltyinä kehittyvässä ja vastasyntyneessä sikiössä.

Tutkimus osoitti, että Foxe3 on välttämätön silmän linssin (mykiön) normaalille kehitykselle. Mykiö oli lähes ainoa elin, jossa Foxe3 voitiin osoittaa sikiökehityksen aikana. Jo hyvin varhaisessa vaiheessa kehitystä, mykiöaiheessa, tarvittiin Foxe3:a. Mykiön myöhemmissä kehitysvaiheissa Foxe3 tarvittiin mykiön etuosan jakaantuvissa soluissa. Aiemmissa tutkimuksissa oli kuvattu hiirellä mykiön kehityshäiriö, jossa mykiön irtaantuminen sikiön ulkokalvosta eli ektodermistä epäonnistuu ja seurauksena on hankala kehityshäiriö, jossa mykiö ja sarveiskalvo ovat yhdistyneenä. Foxe3:n mutaatio osoittautui olevan tämän kehityshäiriön taustalla ja selvitimme, että Foxe3:a tarvitaan pitämään mykiön etuosan solut jakautumiskykyisinä. Myöhemmissä tutkimuksissa on osoitettu että pieni osa ihmisen silmän kehityshäiriöistä johtuu Foxe3:n geenivirheestä.

Saimme tutkimuksissamme viitteitä siitä, että myös Foxe3:n sukulaisproteiinit Foxf1 ja Foxf2 osallistuvat sikiökehityksen säätelyyn. Näillä proteiineilla näytti olevan merkitystä erityisesti suoliston, hengitysteiden ja virtsaelinten kehittymiselle. Foxf1 ja Foxf2 ovat keskenään lähisukulaisia ja niiden säätelytehtävä vaikutti olevan hyvin samantyyppinen ­ joskin löysimme myös eroavaisuuksia. Foxf1 ja Foxf2 osallistuvat elinten kehitykselle välttämättömään epiteeli- ja mesenkyymisolukon väliseen viestintään.

Aikaisemmat tutkimukset poistogeenisillä eläimillä ovat jo osoittaneet, että sukulaisproteiinit Arnt ja Arnt2 ovat tärkeitä normaalille sikiökehitykselle. Ne ovat välttämättömiä partnereita erilaisten sukulais- ja ei-sukulaisproteiinien, esim. dioksiinireseptorin, toiminnalle. Kartoitimme näiden proteiinien yksityiskohtaisen esiintymisen hiiren sikiökehityksen aikana. Tällainen kartoitus toimii jatkossa perusselvityksenä, kun pohditaan, missä elimissä nämä proteiinit voivat muodostaa toiminnallisia yksiköitä partnereittensa kanssa.

Tacc3 löytyi, kun etsittiin Arnt:n kumppaneita koeputkiolosuhteissa. Osoitimme, että myös tämä proteiini ilmentyi useissa hiiren kehittyvissä elimissä. Tacc3 oli havaittavissa erityisesti voimakkaasti jakaantuvissa solukoissa, mikä viittaa siihen, että sillä on tehtävä solujen jakaantumisen säätelyssä. Tacc3 ilmentyi monissa samoissa elimissä kuin Arnt ja Arnt2, mikä viittaisi siihen, että Tacc3 on Arnt:n ja Arnt2:n kanssa toimiva kumppani myös kehittyvissä kudoksissa eikä vain koeolosuhteissa. Tacc3 voitiin osoittaa myös aikuisen hiiren kiveksessä ja munasarjassa ja sillä on ilmeisesti rooli siittiöiden ja munasolujen kehityksessä.

The genes guide the complex process of development, during which the cells divide to enable the growth, differentiate to the specified cells to form the separate organs and orientate themselves to organize the three-dimensional structures. All the genes are not active at the same time, instead they express at separate times to encode the formation of specific proteins needed by cells.

The aim of this study was to examine the regulation of gene expression during development. We have searched and characterized new proteins involved in the developmental processes in mouse, rat and human, studied possible interactions of these proteins, mapped the expression patterns during development and analyzed spontaneous mutants in order to find clues for function.

Specific aims of the study were to investigate and compare the developmental expression of genes encoding closely related forkhead transcription factors Foxf1 and Foxf2 mRNA in development of mouse/rat in order to find out clues about their similarities and differences concerning their biologic functions and to study the expression of Foxe3 in order to understand its biological role. The aims of this study were also to examine the expression of Arnt and Arnt2 mRNA in developing mouse and to and to examine gene and protein expression of a novel Arnt-interacting protein in the developing and adult mouse.

Foxf1 and Foxf2 were previously known to function as transcriptional activators. The expression of Foxf1 and Foxf2 mRNA was studied during embryonic development by in situ hybridization in mouse and rat tissues. The investigation of Foxf2 mRNA expression was continued postnatally. Foxf1 and Foxf2 exhibit largely overlapping expression patterns, although both qualitative and quantitative differences were found. The main sites of expression for both Foxf1 and Foxf2 mRNA were respiratory, alimentary and urinary tract, where the transcripts were localized to the mesenchyme adjacent to the epithelium. This type of expression pattern suggests that these factors may have similar functions in epithelio-mesenchymal crosstalk, which is known to be crucial for organ development. In the unparalleled expression sites (developing central nervous system, eye, ear, and limb buds) Foxf2 may have an independent role as a developmental regulator. The expression of Foxf2 continued until adulthood in the eye, stomach, intestines and lung. In all the other organs the detectable expression ceased within two postnatal weeks.

A mouse homolog of FOXE3 was cloned and sequenced and its role examined in developing mouse. Strong evidence was found that Foxe3 is essential for closure of the lens vesicle and lens epithelial proliferation. Its expression in mouse embryo was limited to the lens of the developing eye and during a short period to a small site on the neural folds in the cephalic region. The expression in the lens was first observed at the start of the lens placode induction around E9.5. Later, the expression in the lens became restricted to the anterior proliferating cells at the time when lens differentiation begins. The chromosomal location of mouse Foxe3 was found to colocalize with that of dyl (dysgenetic lens) mutation. The entire coding region of Foxe3 was sequenced from a homozygous dyl mouse and mutations where found in the part of Foxe3 encoding the DNA-binding domain. These mutations cosegregate with the dyl phenotype (fusion between lens and cornea). The results suggest that mutations in Foxe3 are responsible for the dyl phenotype. Evidence was provided that the role of Foxe3 in the lens epithelial cells might be to promote survival and proliferation while preventing differentiation.

bHLH-PAS proteins Arnt and Arnt2 are transcriptional regulators that function as dimerizing partners for several related and also some non-related partners. We provided a detailed description of the expression of Arnt and Arnt2 mRNA in mouse tissues during embryonic and early postnatal development by in situ hybridization. In contrast to earlier reports, both Arnt and Arnt2 were expressed widely during development, yet showing a temporally and spatially specific pattern. In developing central nervous system, Arnt and Arnt2 were shown to be expressed almost equally. Arnt and Arnt2 were found to be expressed parallel in many tissues where they may compete or substitute for common heterodimerizing partners. Also tissues where they are expressed separately were found, suggesting also discrete functions.

In search for novel Arnt interacting proteins, Aint/Tacc3 was cloned and sequenced. In addition to Arnt, interaction with Arnt2 and minimally with Sim2 were observed. Tacc3 was discovered to be a member of a new TACC family of transforming acidic coiled coil proteins. Tacc3 expression in the central nervous system and in peripheral organs of mouse is highest and most widespread during fetal development from E13 onwards and continuing until 1.5 days after birth. In central nervous system, the expression was first seen in the proliferating neuroepithelium of neural tube and later in primary and secondary germinal matrices at the time when proliferation of neuronal cells occurs. This suggests an important role for Tacc3 in proliferation of neural cells. The expression in peripheral tissues was also associated with most active proliferation period in many organs. The simultaneous expression of Tacc3 with its in vitro interaction partners Arnt and Arnt2 was observed in several ­but not all - sites both in peripheral organs and central nervous system. In some organs the expression continued postnatally; however, in adult mouse high amounts of Tacc3 mRNA were present only in testis and ovary and lower levels were detected in thymus and spleen. The expression in testis was low during pre-natal and early post-natal development. However, when the mice matured and became fertile Tacc3 mRNA levels increased remarkably. Tacc3 mRNA was highly expressed in primary spermatocytes and secondary spermatocytes, which are going through first and second meiotic divisions. The results suggest that Tacc3 has an important role in mammalian spermatogenesis. In ovary, expression of Tacc3 was prominent postnatally and in adult. The high expression of Tacc3 in oocytes suggests that it may have a role in oogenesis.