Inflammatory cytokines and cytokine gene polymorphisms in chronic lymphocytic leukaemia, in primary Sjögren's syndrome and in healthy subjects

Abstract

Sytokiinit ovat joukko liukoisia tulehdusvälittäjäaineita, joiden keskinäinen tasapaino on häiriintynyt monissa sairauksissa. Sytokiinien geenit ovat polymorfisia, ja tämän geneettisen vaihtelun on kuvattu liittyvän vaihteluun yksittäisten sytokiinien tuotantokyvyssä. Tässä poikkileikkaustutkimuksessa tutkittiin sytokiinituotannon häiriöiden ja sytokiinigeenien polymorfismin osuutta kahteen etiologialtaan tuntemattomaan sairauteen, krooniseen lymfaattiseen B-soluleukemiaan (B-KLL) ja primääriin Sjögrenin syndroomaan (pSS). Lisäksi sytokiinigeenien jakautumia ja vaikutuksia terveessä väestössä tutkittiin 400 SPR:n verenluovuttajan aineistossa.

Tutkimuksessa havaittiin, että interleukiini-6 (IL-6) proteiinin plasmapitoisuudet olivat koholla sekä B-KLL:ssa että pSS:ssa. Plasman IL-6 pitoisuudet olivat riippuvaisia B-KLL:n vaikeusasteesta siten, että korkeimmat pitoisuudet tavattiin potilailla joilla oli vaikeusasteluokittelun mukaan lyhin ennuste. Korkea plasman IL-6 liittyi potilailla esiintyvään anemiaan, mataliin hemoglobiinitasoihin sekä korkeaan laskoon. IL-6:sta poiketen interleukiini-1 perheen sytokiinien IL-1b ja IL-1Ra plasmatasot olivat madaltuneet B-KLL:ssä. Korkea plasman IL-1b taso ja matala IL-1Ra/IL-1b suhde liittyivät B-KLL:ssa ei-etenevään tautimuotoon. Kuten B-KLL:ssa, myös pSS:ssa plasman IL-6 tasot vaihtelivat taudin ilmenemismuodoista ja taudin vaikeusasteesta riippuen. Plasman IL-6 pitoisuudet korreloivat lähes lineaarisesti pienten sylkirauhasten histopatologiseen lymfosyytti-infiltraatioon, jota on pidetty taudin vaikeusasteen yhtenä tärkeimpänä mittarina. Lisäksi korkea plasman IL-6 pitoisuus liittyi pSS-potilailla esiintyvään pleuriittiin, perifeerisen hermoston oireisiin ja keliakiaan.

IL-1 geeniperheen ja IL-6 geenin alleelijakaumat eivätkä alleelien vaikutukset ko.sytokiinien tuotantoihin poikenneet B-CLL-potilaiden ja normaaliväestön välillä toisistaan. IL-1 geeniperheen alleelivaikutus IL-1b plasmatasoihin selittyi normaaliväestössä tämän geeniperheen eri haplotyyppien yhteisvaikutuksen kautta, ja harvinaisimman IL-1 haplotyypin omaavilla kohdehenkilöillä tavattiin ko. proteiinin korkeimmat plasmatasot. IL-6 geenin promoottorialueen polymorfia sääteli IL-6 tasoja pSS:ssä, mutta tämän polymorfian alleelijakauma ei poikennut pSS potilaiden ja normaaliväestön välillä. IL-10 geenin alleelijakauma sen sijaan poikkesi pSS potilailla normaaliväestöstä siten, että korkeaan IL-10 tuotantoon liittyvien IL-10 geenin promoottorialueen haplotyyppien esiintymistiheys oli potilailla noussut.

Nämä ennakkotulokset vahvistavat oletusta, että IL-6 plasmatasojen mittausta voitaisiin käyttää apuna B-CLL:n ja pSS:n vaikeusasteen määrittämisessä ja plasman IL-1Ra/IL-1b suhteen määritystä B-CLL:n etenemisnopeutta ennustavana laboratorioparametrina. Tulokset viittaavat myös siihen, että korkealla IL-1b aktiivisuudella saattaa olla B-KLL:n etenemiseltä suojaava vaikutus. IL-1 geeniperheen tai IL-6 geenin promoottorialueen polymorfioita ei kuitenkaan voida käyttää B-KLL:n riskinarvioinnissa, eikä näiden geenien alleelinen epätasapaino aiheuta taudissa tavattavia sytokiinituotannon häiriöitä. Tämä negatiivinen tulos pätee myös IL-6 geenin polymorfiaan pSS:ssä. IL-10 geenin haplotyyppien jakautumien poikkeavuus pSS:ssa viittaa siihen, että IL-10 geenin määrätyt haplotyypit, tai näihin kytkeytynyt toistaiseksi vielä tunnistamaton geneettinen tekijä altistaa potilaita pSS:lle. IL-10 haplotyyppien ja IL-10 proteiinituotannon välisten yhteyksien vuoksi on todennäköistä, että tautiriskin lisääntyminen ainakin osin välittyy lisääntyneen IL-10 tuotannon kautta. Yksittäisen poikkileikkaustutkimuksen antama informaatio tässä suhteessa on kuitenkin rajallinen, ja kontrolloitujen pitkäaikaistutkimusten tarve on ilmeinen.

In this dissertation we studied two aetiologically unknown disorders (B cell chronic lymphocytic leukaemia and primary Sjögren's syndrome) with imbalanced cytokine production in order to find out whether these imbalances have an effect on disease phenotype or severity. Several cytokine gene polymorphisms were studied in these patients in order to find out whether the allelic imbalance of these genes predisposes patients to disease, or whether disturbed cytokine profiles are caused by these genetic factors. Moreover, circulating cytokines and polymorphisms of corresponding genes were studied in a cohort of healthy subjects.

The role of in vitro IL-6 and TNF-a production was studied in 24 patients with B-CLL. The role of circulating IL-1b, IL-1Ra and IL-6 and several polymorphic sites of corresponding genes were studied in 36 patients with B-CLL. Circulating IL-6 and IL-10 and the genetic polymorphism of these genes were studied in cohorts of 66 and 62 patients with pSS. The cytokine gene polymorphisms of IL-1a, IL-1b, IL-1Ra, IL-6 and IL-10 were studied in a cohort of 400 healthy Finnish Red Cross Transfusion Service blood donors, who also served as controls for allele frequency analyses and cytokine production studies.

The in vitro and in vivo production of IL-6 was stage dependent in B-CLL. The cellular release of IL-6 (and to a lesser extent TNF-a) was decreased in Binet C stage patients, who by contrast have the highest circulating IL-6 levels. The overall plasma IL-6 was increased in B-CLL compared to levels of normal subjects. Plasma IL-6 was shown to be associated with anaemia, haemoglobin levels and with ESRs in B-CLL patients. In contrast to IL-6, baseline plasma concentrations of IL-1b and IL-1Ra were diminished in B-CLL. High circulating IL-1b was associated with non-progressive disease and the plasma IL-1Ra/IL-1b ratio was strikingly low in the patients with non-progressive B-CLL. High plasma IL-1b was associated with atypical B-CLL immunophenotype in B-CLL. The allele distributions of IL-1 family genes and IL-6 gene were similar in B-CLL patients and in healthy control subjects.

These data suggest that other mechanisms than allelic imbalance cause the distinct IL-1b, IL-1Ra and IL-6 profiles in B-CLL. The normal allelic distribution of corresponding genes in B-CLL exclude the possibility that the polymorphic loci of these genes could be used in the risk-assessment of B-CLL. The association of high IL-1b activity in non-progressive disease indicates that high IL-1b has a protective role in the disease. These results also suggest that high plasma IL-6 is a good potential candidate marker for inferior prognosis in B-CLL. Moreover, high plasma IL-1b and low plasma IL-1Ra/IL-1b ratios are potential candidate markers for non-progressive B-CLL. These preliminary results emphasize the need for longitudinal studies concerning the role of these proteins in B-CLL.

The plasma levels of IL-6 were increased in pSS and high plasma IL-6 was associated with lymphocyte focus score and specific extraglandular manifestations such as coeliac disease, pleuritis and peripheral nervous system symptoms of the disease. The circulating IL-10 levels were also higher in pSS patients than in control subjects, but this difference was not statistically significant. The plasma IL-6 and IL-10 concentrations were dependent on the IL-6 or IL-10 allelic status of the pSS patients. The allelic distribution of IL-6 -174 polymorphism was similar in patients and controls. In contrast to IL-6 alleles, the frequency of IL-10 gene GCC haplotype increased, and the frequency of ACC haplotype decreased in pSS when compared with the control population. Plasma IL-10 was not associated with disease phenotype or disease activity markers in pSS.

The complementary histological and clinical findings concerning IL-6 strongly suggest that IL-6 may be used as a surrogate marker for severity of pSS. These findings also suggest that IL-6 may be involved in the development of some of extraglandular disease manifestations in pSS. The normal IL-6 allele distribution in pSS excludes the possibility that allelic imbalance of this gene is a primary cause for the overall increase of plasma IL-6 in pSS. In contrast to IL-6 polymorphism, polymorphism of the IL-10 gene seems to be a predisposing factor for pSS. The increase of GCC, IL-10 "high producer" haplotype may partly explain increased IL-10 observed earlier in pSS. Due to the subtle nature of allelic effects, larger cohorts and longitudinal studies are needed to find phenotypic effects of allelic imbalance in IL-10 gene.

We also demonstrated that the baseline plasma levels of IL-1b are genetically regulated in healthy subjects by IL-1a polymorphism. This genetic effect could be observed only in those subjects who were homozygous for allele 2 of the IL-1a gene. Moreover, IL-1b (-511) allele 2 had a cumulative effect on the IL-1a allele 2.2 homozygosity-associated high IL-1b. These results suggest that IL-1a allele 2 regulates IL-1b production indirectly by IL-1a production, or that this allele contains or codes for a regulative element enhancing the transcription of itself and the adjacent genes. No statistically significant differences in plasma IL-6 or IL-10 were observed, when healthy controls were categorized on the basis of IL-10 haplotypes. This suggests that IL-10 and IL-6 polymorphisms regulate primarily inducible cytokine responses or that basal and induced responses of these cytokines are differently regulated.