Interferon-gamma-activated gene expression: molecular mechanisms of Stat1-mediated transcription

Abstract

Immuunijärjestelmä on kehittynyt suojaamaan elimistöä erilaisilta taudinaiheuttajilta. Järjestelmään kuuluu useita valkosolutyyppejä, joiden kasvua, erilaistumista ja toimintaa säätelevät lukuisat solunulkopuoliset molekyylit. Näistä suuri ja tärkeä ryhmä ovat sytokiinit. Ne toimivat sitoutumalla kohdesolunsa pinnalla oleviin vastaanottajamolekyyleihin eli reseptoreihin. Sitoutumisen seurauksena reseptorit aktivoituvat ja käynnistävät sarjan reaktioita solun sisällä. Reaktiot toimivat signaaleina, jotka lopulta välittyvät solun tumaan ja siellä sijaitseviin kohdegeeneihin. Sytokiinit toimivat siis vaikuttamalla geenien luentaan.

Sytokiinit signaloivat kaikki samalla periaatteella, ns. Jak/Stat-reitin välityksellä. Siinä reseptoreihin liittyneet Jak-tyrosiinikinaasit aktivoituvat reseptorin aktivoituessa ja aktivoivat puolestaan Stat-molekyylejä, jotka kulkeutuvat tumaan ja sitoutuvat siellä kohdegeeniensä säätelyalueille toimien ns. transkriptiotekijänä. Jak/Stat-signalointireitin pääpiirteet on selvitetty, mutta Stat-molekyylien toimintamekanismissa riittää vielä tutkittavaa. Väitöstutkimuksen yhtenä tarkoituksena olikin selvittää, miten Statit säätelevät vain tietyissä kudoksissa ilmeneviä geenejä. Tutkimuskohteeksi valittiin interferoni gamma ja sen signaalireitti, jossa keskeisenä osana on ensimmäisenä löydetty Stat-molekyyli, Stat1. Malligeeninä käytettiin Fc gamma ­reseptori I:tä, joka koodaa immuunijärjestelmän syöjäsolujen, makrofagien, pinnalla olevaa proteiinia. Tämä reseptori on keskeinen makrofagien toiminnassa, ja sen määrä makrofagin pinnalla lisääntyy interferoni gamman vaikutuksesta.

Fc gamma ­reseptori I-geenin säätelymekanismeja analysoitiin käyttämällä useita solu- ja molekyylibiologisia menetelmiä, ja materiaalina oli viljeltyjä solulinjoja. Tutkimuksessa selvitettiin eri säätelyproteiinien yhteistyötä Fc gamma ­reseptori I-geenin ilmentymisessä interferoni gamma-stimulaation jälkeen. Stat1-transkriptiotekijän lisäksi geenin säätelyalueella tarvitaan PU.1-säätelyproteiini, mutta suoraa fyysistä vuorovaikutusta Stat1:n ja PU.1:n välillä ei havaittu. Sen sijaan PU.1 toimii vuorovaikutuksessa TBP:n ja RNA-polymeraasin, geenin luentaan osallistuvien proteiinien, kanssa geenin säätelyalueella.

Lisämunuaisen kuorikerroksen erittämillä glukokortikoidihormoneilla on lukuisia tehtäviä elimistössä. Ne mm. vaikuttavat immuunijärjestelmän toimintaan, ja ovatkin tärkeitä lääkkeitä esim. astman hoidossa. Yhden väitöskirjan osatyön tarkoituksena oli selvittää, mihin glukokortikoidien ja interferoni gamman yhteisvaikutus Fc gamma ­reseptori I-geenin luennan lisääntymisessä perustuu. Tutkimuksessa havaittiin, että glukokortikoidit lisäävät luentaa oman reseptorinsa kautta. Glukokortikoidireseptori ei kuitenkaan itse sitoudu Fc gamma ­reseptori I-geenin säätelyalueelle eikä ole fyysisessä vuorovaikutuksessa Stat1:n kanssa, vaan lisää jonkin toisen, geeniluentaa aktivoivan, proteiinin luentaa. Väitöskirjan viimeisessä osatyössä verrattiin ns. PIAS-proteiinien vaikutusta toisaalta sytokiinien ja toisaalta steroidihormonien, kuten testosteronin, glukokortikoidien ja estrogeenin, säätelemään geeniluentaan, ja havaittiin, että vaikutus kohdistui pääasiallisesti steroidivälitteiseen geeninsäätelyyn.

Väitöskirjatutkimuksessa on selvitetty keskeisten immuunipuolustustoimintojen molekyylitason mekanismeja. Tulokset auttavat ymmärtämään elimistön viruspuolustusta ja lääkeaineina runsaasti käytetyjen steroidien vaikutuksia elimistössä.

Interferons are a group of secreted proteins belonging to the large family of cytokines. They have a critical role in the immune system in providing an early line of defence against viruses. Interferon-gamma (IFN-gamma) is also an important activator of monocytes and macrophages. One of the target genes for IFN-gamma in macrophages is the high affinity receptor for immunoglobulin G, FcgammaRI, which mediates phagocytosis, antibody-dependent cytotoxicity and respiratory burst. IFN-gamma binds to its specific receptor on the cell surface, and the signal is transduced into the cell via the JAK/Stat pathway. The receptor-associated JAK tyrosine kinases are activated upon IFN-gamma binding and activate cytoplasmic latent Stat1 transcription factors by tyrosine phosphorylation. Stat1 molecules form dimers and translocate into the nucleus where they recognize their specific DNA binding elements and regulate transcription of IFN-gamma-responsive genes. The molecular mechanisms of Stat-mediated transcription are not yet fully understood. The aim of this study was to establish a model system for analysing the functions and molecular mechanisms of Stat1 and other transcription factors in the tissue-specific expression of cytokine-responsive genes. Myeloid cell-specific IFN-gamma-stimulated activation of the FcgammaRI gene was strictly dependent on binding of two factors, Stat1 and PU.1, to the promoter. The DNA binding and transactivation functions of both proteins were required, but no physical interaction between the factors was involved. PU.1 was found to mediate contacts with basal transcription machinery components TATA-binding protein and RNA polymerase II, whereas Stat1 recruited the coactivator protein CBP/p300 to the promoter. The mechanism by which glucocorticoids augment IFN-gamma-induced activation of FcgammaRI in macrophages was investigated in the same model system. Glucocorticoid receptor (GR), a sequence-specific transcription factor belonging to the family of nuclear hormone receptors, was found to cooperate with Stat1 and PU.1 by an indirect mechanism involving the DNA binding and transactivation functions of GR and Stat1. No physical association between Stat1 and GR was demonstrated, and the requirement of glucocorticoid-induced protein synthesis suggests the involvement of newly produced transcriptional coregulators. The roles of PIAS (protein inhibitor of activated Stat) proteins, which have been described as negative regulators for Stats, were analysed in the modulation of cytokine-responsive genes. In the experimental conditions used in this study, none of the PIAS proteins was found to significantly affect transcriptional activation mediated by any of the Stats analysed in the study. In contrast, all PIAS proteins were able to modulate steroid receptor-dependent transcription positively or negatively, depending on the promoter and cell type.