Genetic selection in human mitochondria

Abstract

Eukaryoottisolujen energiantuotanto tapahtuu mitokondrioissa. Tämän lisäksi mitokondrioilla on monia tehtäviä useissa solun perustoiminnoissa, kuten solun jakaantumisen ja eliniän säätelyssä, ionitasapainossa, rasvojen hajoituksessa, aminohappojen synteesissä, ikääntymisessä jne. Ihmisellä tunnetaan nykyään monia perinnöllisiä tauteja, jotka johtuvat mitokondrioiden toiminnan häiriöistä. Mitokondriaalisille sairauksille on tyypillistä, että sama mutaatio voi aiheuttaa joukon hyvin erilaisia oireita eri ihmisillä. Tavallisesti oireet ilmenevät lihaksistossa, hermostossa ja aisteissa (etenkin kuulo- ja näkö-). Lisäksi muutokset mitokondrioissa voivat aiheuttaa solujen epänormaalia käytöstä, kuten hedelmättömyyttä ja syöpää.

Mitokondriot sisältävät omaa DNA:ta koodaten useita hengitysketjun proteiineissa olevia polypeptidejä (ihmisellä 13) sekä näiden proteiinisynteesissä tarvittavat RNA-molekyylit (tRNA:t ja rRNA:t). Kaikki muut proteiinit koodataan tumassa ja tuotetaan sytoplasmassa, josta ne kuljetetaan mitokondrioihin. Onkin hyvin tärkeätä oppia ymmärtämään, kuinka solun kaksi genomia, tuman ja mitokondrioiden, toimivat yhdessä, ja kykenevät tuottamaan toimivia hengitysketjun proteiinikomplekseja.

Väitöskirjatyössäni olen tutkinut leusiini-siirtäjä-RNA:n mutaation (A3243G) vaikutusta mitokondrioiden proteiinisynteesin. Tämä mutaatio aiheuttaa hyvin laajan kirjon sairauksia ihmisillä, joko diabetesta ja/tai kuuroutta, luurankolihaksen, silmän tai sydämen lihassairautta tai MELAS syndrooman (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and strokelike episodes). A3432G mutaatio vähentää mitokondriaalisten proteiinien tuottoa ja lisäksi tuottaa vääriä polypeptidejä vaikuttaen siten koko solun energian tuotantoon ja soluhengitykseen. Tämä on seurausta sekä vähentyneestä siirtäjä-RNA:n määrästä, että heikentyneestä aminoasylaatiosta. Lisäksi on mahdollista, että RNA:n muokkaus ja kodonien tunnistus ovat heikentyneet. Toinen pistemutaatio, ns. suppressorimutaatio mitokondrion siirtäjä-RNA:ssa (tRNA-Leu(CUN)) palauttaa solun proteiinisynteesin normaaliksi tutkituissa soluissa. Tämä mutaatio mahdollistaa mutatoituneen (tRNA-Leu(UUR)) siirtäjä-RNA:n kodonien lukemisen. Tämänkaltainen vaimentava mutaatio on ensimmäinen, joka on löydetty eukaryoottisoluista. Näiden kahden mutaation esiintyminen yhdessä on selvittänyt merkittävästi proteeinisynteesin mekanismeja ihmisen mitokondrioissa.

Lisäksi olen selvittänyt kuinka mitokondriaalinen DNA siirtyy solusukupolvelta toiselle. Koska solussa on tuhansia kopioita mitokondriaalista DNA:ta, ja etenkin tauteja aiheuttavat mutatoituneet molekyylit esiintyvät normaalien molekyylien kanssa samassa solussa, on hyvin tärkeätä ymmärtää, mikä säätelee mitokondriaalista periytymistä. Mitokondrioiden DNA on organisoitunut ns. nukleoidiksi, joka on proteiini-DNA-kompleksi. Näiden määrä vaihtelee solutyypistä toiseen. Olen osoittanut, että solunjakaantumisessa itsenäisesti siirtyvien DNA-molekyylien määrä on yli tuhat, joka on selvästi suurempi kuin nukleoidien määrä. Tämä voidaan selittää siten, että mitokondriaalisen periytymisen yksikkö on nukleoidi, joka sisältää mahdollisesti useita erilaisia DNA-molekyyleja, kuitenkin niin, että solun kaikki nukleoidit ovat samanlaisia ja ne replikoidaan siten, että tytärnukleoidit säilyvät samanlaisina. Nämä tulokset auttavat ymmärtämään, kuinka mitokondrioiden proteiinimetabolian virheet aiheuttavat ihmisen sairauksia, ja kuinka nämä mutaatiot siirtyvät sukupolvelta toiselle.

Mitochondrial mutations are involved in a number of diseases in humans. One of the commonest classes of these mutations is in the gene for tRNA-Leu(UUR). I have studied the A3243G mutation in human cybrid cells. This mutation can cause a wide variety of disorders, varying from diabetes and/or deafness, skeletal or ocular myopathy to the full MELAS syndrome (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and strokelike episodes). In lung carcinoma cybrid cells, the A3243G mutation was found to be associated with a decreased level of both the amount of tRNA-Leu(UUR) and the extent of its aminoacylation. This was accompanied by both quantitative and qualitative defects in mitochondrial protein synthesis and poor respiration of the cells. I identified a cybrid cell-line having 99% mutant mtDNA at np 3243 but with a normal cellular phenotype. This phenotypic suppression was shown to be associated with heteroplasmy for another point mutation in mtDNA (G12300A), in the anticodon of tRNA-Leu(CUN). The G12300A mutation creates a suppressor tRNA able to read Leu(UUR) codons. This is the first suppressor mutation of its kind to be described in mammalian cells. It provides strong evidence that the protein synthesis defect caused by the A3243G mutation is due primarily to a deficiency of Leu(UUR) decoding capacity, at least in the lung carcinoma background. In addition, I have studied mtDNA segregation in heteroplasmic cells containing the A3243G mutation, with or without the G12300A suppressor. The number of independently segregating units was found generally to be greater than 1000, regardless of the presence or absence of the G12300A suppressor, i.e. at least an order of magnitude greater than described earlier in the mouse germ-line. The number of mtDNA nucleoids in the same cells was estimated to be approximately 50-100, based on the use of a transiently expressed reporter protein targeted to nucleoids. These studies have given rise to a new model for mtDNA organization and maintenance in the cell, ba sed on the idea of faithfully duplicated mtDNA nucleoids that can themselves be heteroplasmic. One sub-culture of the cell-line containing the G12300A suppressor mutation was found to have undergone a transient episode of much faster mitotic segregation, resulting in diverse heteroplasmy levels. This mitochondrial genomic instability was shown to be associated with the gain of an additional copy of chromosome 9. Cells with trisomy 9, that had experienced transient mitotic segregation but had now re-established stable heteroplasmy, had the same number and subcellular distribution of mitochondrial nucleoids as cells containing two copies of chromosome 9, and which had exhibited heteroplasmic stability continuously. These findings reveal important effects of both the nuclear and mitochondrial genomes in modifying the phenotypic effects of a mtDNA disease mutation.