Potential Use of Polymersomes and Lipid Nanocapsules as Therapeutic Carriers in the Rat Inner Ear

Abstract

Euroopassa 60 miljoonaa henkilöä (13 %) sairastaa kuulon heikkenemistä ja n. 250.000 on kuuroja. Tavanomaiset hoitomenetelmät eivät tuota tulosta sisäkorvaperäisen kuulonalennuksen hoidossa. Hoitoon tulisi kehittää uusia menetelmiä ja tekniikoita, kuten kasvutekijöitä, geenisiirtoa ja lääkkeitä ja nämä tulisi kuljettaa kohteeseen käyttäen nanopohjaisia tekniikoita riittävän tehon saavuttamiseksi. Nanokuljettimien hyvä ominaisuuksia ovat mm. ne säätelevät lääkkeen vapautumista, suojaavat geenejä entsyymien hyökkäystä vastaan ja kuljettavat lääkkeen kohdesoluihin. Toistaiseksi tietoa kohdennetuista nanokuljettimista on vain rajoitetusti. Nanokuljettimina on aikaisemmin hyödynnetty käyttäen mm. monihaaraista polylysiiniä (HBPL); liposomeja ja poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) nanopartikkeleita geenien, lääkkeiden ja merkkiaineiden kuljetuksessa sisäkorvassa. Tässä tutkimuksessa selvitettiin polymerosomien (PM) ja rasva-nanokapsselien (LNC) käyttöä nanokuljettimina rotan sisäkorvassa. Tutkimuksessa tarkasteltiin nanopartikkeleiden jakautumista, kohdentamista ja kudosystävällisyyttä sisäkorvassa. Ensin selvitettiin ns. autofluoresenssin poistomenetelmiä, joilla nanopartikkeleiden merkkiaineiden tarkkuutta voitiin parantaa. Seuraavaksi selvitettiin PM:n kulkua sisäkorvassa ja TAT tai tet1 peptideillä funtionalisoitujen PM:n jakautumista sisäkorvassa ja kohdistamista kohdesolukkoihin. Lisäksi selvitettiin miten eri sisäkorvan LNC partikkeleiden vientimenetelmät vaikuttavat siihen, miten nanokuljettimet leviävät eri kudosaitioihin ja miten kudosystävällisiä ne ovat.

Sisäkorvan kudossaarekkeessa autofluoresenssia oli havaittavissa sekä sisäisissä ja ulkoisissa karvasoluissa, kuulohermon soluissa, verisuoniverkoston reunasoluissa, spiraali ligamentin fibrinosyyteissä, scala tympanin sidekudossoluissa ja Reissnerin kalvon pintasolukossa. Autofluoresenssi väheni, kun näytettä käsiteltiin 1 mM kuparisulfaatilla samalla kun käsittely ei poistanut nanopartikkelin pinnalla olevan DiI-merkkiaineen fluoresenssia ja PM:n havaittavuutta. Eri nanopartikkeleiden annostelumenetemät aiheuttivat erilaisen nanopartikkeleiden leviämisen sisäkorvassa: sisäkorvaan ruiskutettuja PM:a havaittiin spiraali ligamentissä, kuulohermossa, Cortin elimen alapuolella sidekudoksessa. Välikorvaan ruiskutettuja PM:a havaittiin spiraali laminassa ja sen alapuolisessa sidekudoksessa. Pyöreän ikkunan kautta annosteltuja PM:a havaittiin vain spiraali laminassa. Tasapainoelimessä sisäkorvaan ja välikorvaan annostellut PM:t levisivät laajemmalle kuin pyöreän ikkunan kautta annostellut PM:t. TAT-PM:t aiheuttivat voimakkaamman fluoresoinnin pyöreässä ikkunan kalvossa, spiraali ligamentissä ja sen alaisessa sidekudoksessa kuin verrokki PM:t. tet1-PM:iä havaittiin kuulohermossa kun lume-tet1-PM:ä havaittiin kauempana kuulohermosta. LNC läpäisi pyöreän ikkunan ja kulkeutui stria vaskularikseen ja spiraali ligamenttiin. Nanopartikkelit eivät aiheuttaneet havaittavia kudosvaurioita tai sivuvaikutuksia in vivo kokeissa.

Tutkituista nanopartikkeleista sekä PM että LNC läpäisevät pyöreän ikkunan ja ne kulkeutuvat sisäkorvan soluihin. Tutkimukset PM:llä osoittavat, että annostelutavalla on vaikutuksensa siihen, kuinka laajalle sisäkorvaan PM:t kulkeutuvat. Välikorvaan ruiskutettuna PM:a oli runsaammin tasapainoelimessä kuin kuuloelimessä osoittaen että soikea ikkuna läpäisee nanopartikkeleita paremmin kuin pyöreä ikkuna. Suoraan sisäkorvaan ruiskutetut PM:t levisivät laajimmin, koska nanopartikkeleiden ei tarvitse läpäistä välikorvan ja sisäkorvan välisiä kalvoesteitä. Sisäkorvahoitoa suunniteltaessa tulee harkita minne nanopartikkelien halutaan leviävän ja sen perusteella voidaan valita oikea annostelumenetelmä. Tulokset osoittavat, että kalvoston läpäisevyyttä voidaan parantaa käyttämällä TAT-peptidillä funktionalisoitua PM:a. Kohdentamista tiettyyn kudos- tai solutyypin voidaan parantaa käyttämällä kohdistin molekyylejä, kuten tet 1 PM: pinnalla. Sekä PM että LNC ovat mahdollisia lääkkeiden ja geenien kuljettimia tulevaisuuden sisäkorvahoidoissa. Tutkimukset PM:n ja LNC:n sopivuudesta osoittavat, että muokkaamalla nanopartikkeleiden rakenteita ja ominaisuuksia voidaan parantaa kohdentamista ja leviämistä sisäkorvan eri kudoksiin.

The traditional treatment strategies for sensorineural hearing loss (SNHL) have not been very satisfied. A cure for SNHL would thus depend on new technologies such as gene or drug delivery using nanocarriers to achieve an ideal effect. Nanocarriers are used as vectors in controlling drug release, protecting gene degradation by enzymes, and targeting therapeutic delivery. Nanocarriers, such as hyperbranched polylysine, liposomes and poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) carrying genes, drugs and fluorophores, have been investigated in the inner ear. However there is no literature report on targeted inner ear drug or gene delivery using nanocarriers. In this study, potential use of polymersomes (PMs) and lipid nanocapsules (LNCs) as nanocarriers in rat inner ear respect to the inner ear distribution, targetability and biocompatibility was investigated. Firstly, quenching effect of copper sulfate (CuSO4) on autofluorescence and 1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine-perchlorate (DiI)-encapsulated PMs were investigated. Then the distribution of PMs and TAT (TAT-PMs) or Tet1 (Tet1-PMs) peptide functionalized PMs in rat inner ear was detected; the effect of delivery methods on PM entering into the inner ear was evaluated; and the distribution and biocompatibility of the LNCs in rat inner ear were investigated.

In whole mounted specimens, autofluorescence was observed in the subcuticular cytoplasm of inner hair cells (IHCs), the OHCs, the SGCs, the strial marginal cells, the spiral ligament fibrocytes, the mesothelial cells of the scala tympani below the basilar membrane, and the epithelial cells of the Reissner s membrane. This autofluorescence could be quenched by treatment of 1 mM CuSO4 (pH 5.0). At the same time the CuSO4 treatment did not affect the fluorescence of DiI encapsulated in the PMs (p > 0.05, Kruskal-Wallis test). Different delivery methods induced different distribution pattern of the PMs: cochleostomy resulted in distribution of the PMs in the spiral ligament (SL), mesothelial cells beneath Corti s organ, supporting cells in Corti s organ, and spiral ganglion cells (SGCs); transtympanic injection induced uptake of the PMs in the SL and mesothelial cells beneath Corti s organ; topical round window membrane (RWM) surface administration showed distribution of the PMs only in SL. In the vestibulum, transtympanic injection and cochleostomy induced more distribution of the PMs than did topical RWM surface delivery (p Both PMs and LNCs can pass through the RWM and internalized by the cochlear cells. Study of PMs showed that delivery methods affect the distribution of the PMs in the inner ear cells. After transtympanic injection, more PMs were detected in the vestibulum than in the cochlea, indicating that the PMs entered the vestibulum through the oval window. Administration via cochleostomy displayed the broadest distribution of PMs in the inner ear, because this method avoids the barriers between the middle ear and the inner ear. So it is necessary to choose optimal delivery method according to the purpose of treatment. The results suggest that enhanced permeability through the RWM can also be achieved by using TAT peptide functionalized PMs. Further more specific targeting to the cochlear nerve can be achieved by functionalizing the PMs with Tet1 peptides. Both PMs and LNCs are potential nanocarriers to carry drugs and genes in the future to perform inner ear therapeutics. The study of PMs and LNCs is still in its initial stage. More investigation of the PMs and LNCs is needed in the future work.