Modification of structural and functional properties of avidin protein using targeted random mutagenesis

Abstract

Biokemiallisten ja lääketieteellisten tutkimusmenetelmien kehittyessä, ominaisuuksiltaan erityisien proteiinien tarve kasvaa koko ajan. Suuren mielenkiinnonkohteena ovat molekyylit, jotka kykenevät tarkkaan ja spesifiin molekyylitunnistukseen. Nykyteknologialla on mahdollistaa valmistaa mm. sellaisia proteiinirakenteita, joita ei esiinny luonnossa lainkaan. Lisäksi moderneilla tekniikoilla voidaan parantaa proteiinien ominaisuuksia sekä jopa luoda proteiineille uusia toimintoja.

Väitöskirjatutkimuksessa muokattiin kananmunanvalkuaisen proteiinia, avidiinia, bioteknologian sovellutuksiin paremmin sopivaksi muuttaen proteiinin rakennetta ja toimintaa. Uusien molekyylien lisäksi tutkimus toi lisätietoa avidiinin kyvystä sitoa pienmolekyylejä. Tutkimuksessa avidiinin kolmiulotteinen rakenne määritettiin korkealla resoluutiolla. Lisäksi havaittiin avidiinin tynnyrirakenteen beta-säikeiden 3 ja 4 välissä olevan silmukan tärkeys ligandin sitomisessa.

Tutkimuksessa lisättiin myös aikaisemmin kehitetyn kaksoisketjuavidiinin käytettävyyttä valmistamalla kimeerinen kaksoisketjuavidiini yhdistämällä avidiini ja avidiinin kaltainen proteiini (AVR4). Kehitetyllä kimeerisellä kaksoisketjuavidiinilla havaittiin parantuneet proteiinituottotasot sekä lämmönkestävyys verrattuna alkuperäiseen kaksoisketjumolekyyliin. Lisäksi proteiinia koodaavan DNA-ketjun monistaminen PCR-menetelmällä oli tehokkaampaa kimeerisen fuusiogeenin avulla. Tämä mahdollistaa mm. satunnaismutageneesimenetelmän käytön molekyylin edelleen kehittämisessä.

Avidiinin rakenteeseen kohdistuvan muokkauksen lisäksi tutkimuksessa muunnettiin myös avidiiniproteiinin toimintaa. Avidiinin ligandisitomista muutettiin modifioimalla silmukka-alueita. Kohdennetun satunnaismutageneesin avulla valmistettiin geenikirjastoja, joiden seulontaan käytettiin faagidisplay-menetelmää. Seulonnan tuloksena löydettiin lämmönkestäviä avidiinimutantteja, jotka sitovat steroidihormoni testosteronia. Lisäksi affiniteettia avidiinin luonnolliseen ligandiin saatiin heikennettyä merkittävästi. Tämä tutkimustulos osoittaa sen, että avidiinia voidaan käyttää monipuolisesti tunnistusmolekyylien kehityksessä.

Aikaisemmin muokatun avidiiniproteiinin korkea lämpökestävyys ja erityinen ligandin sitomiskyky valjastettiin käyttöön tutkimuksen osatyössä, jossa kehitettiin bioaktiivisia kalvoja. Selluloosa-asetaattikalvot päällystettiin muokatulla kimeerisellä avidiinilla ja kalvojen bioaktiivisuutta seurattiin kolmen kuukauden ajan. Kalvojen bioaktiivisuus säilyi lähes muuttumattomana seurannan ajan, vaikka kalvot säilytettiin huoneenlämmössä. Kehitettyjä kalvoja voidaan käyttää perustana useissa sovelluksissa, esimerkiksi diagnostisten pikatestien kehityksessä.

In recent years, the development of novel scaffolds from non-immunoglobulin proteins have been an area of great intrest, and a powerful new technology has been born. Today, it is possible to design structures never seen before in nature and to generate proteins with improved suitability for biomedical and biochemical applications. With modern techniques, the affinity and specificity of target proteins can be enhanced, and novel functions or activities can even be added to modified proteins. Additionally, proteins with more stable structures or higher solubility have been created, thus increasing the expression of recombinant proteins. Ongoing research may answer the increasing need for molecules capable of more sensitive and specific recognition in biotechnology applications. Further research will provide valuable knowledge about molecular recognition and protein structure-function relationships.

The aim of this study was to develop novel molecules for avidin-based technologies and, at the same time, to acquire more information about the ligand-binding properties of avidin. A high-resolution 3D -structure of avidin was determined, and it revealed an important role for the loop between beta-strands 3 and 4 in ligand binding. Analyses of the binding of avidin and avidin-related protein 4 (AVR4) to azo dyes showed clearly different binding modes for each protein. Therefore, molecular docking was used to analyze the difference in binding. This experiment also highlighted the importance of the loop between beta-strands 3 and 4 in ligand-binding.

In this study, the avidin protein was extensively modified to be more suitable for diagnostic and biochemical applications. The utility of the original dual-chain avidin protein was improved by constructing chimeric dual-chain avidin proteins consisting of a fusion of circularly permutated wild-type (wt) avidin and circularly permuted AVR4. The chimeric tandem fusion showed enhanced protein expression and thermal stability compared to the original dual-chain avidin. Moreover, PCR amplification was more straightforward for the chimeric protein. Interestingly, binding analyses of the chimeric tandem fusion showed heterogeneous biotin-binding.

In addition to circular permutation, the loop areas in the ligand-binding site of wt avidin were modified in this study. The loop area was subjected to targeted random mutagenesis, and genes carrying the desired mutations were selected from a library by the phage display method. For selection, avidin was displayed on the M13 phage as a fusion with the coat protein p3. As a result, thermostable avidin variants with micromolar affinity for the steroid hormone testosterone were obtained. In terms of ligand binding, the steroid-binding avidin preferred steroids to its natural ligand, biotin.

To further advance the possibile applications of avidin-biotin -technology, avidin-coated cellulose acetate-films were developed. Films covered with thermostable chimeric avidin and stored at room temperature remained biologically active during three-month test period. These films could be used as a universal base for various applications, including in diagnostic platforms.