Protein kinase C in the Regulation of Inflammatory Genes iNOS and TTP

Abstract

Tulehdus on elimistön puolustusreaktio taudinaiheuttajia ja kudosvauriota vastaan. Jos tulehdusreaktion säätely häiriintyy, se voi johtaa tulehdustaudin, kuten reuman tai astman syntymiseen. Väitöskirjatutkimuksessaan proviisori Tiina Leppänen tutki tulehdusgeenien säätelyä. Tutkimuksessa löydettiin uusia keinoja hillitä haitallista tulehdusreaktiota proteiinikinaasi C:n kautta.

Nykyiset astma- ja reumalääkkeet vaimentavat tulehdusta estämällä tulehduksen välittäjäaineita. Useissa tapauksissa lääkkeiden käyttöä rajoittavat kuitenkin riittämätön teho tai haittavaikutukset. Tulehdusreaktion perusmekanismien selvittäminen on tärkeää uusien, tehokkaampien lääkkeiden kehittämiseksi. Väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia proteiinikinaasi C -entsyymiperheen merkitystä tulehdusreaktiota ohjaavien välittäjäaineiden ja tulehdusgeenien säätelijänä.

Väitöskirjatutkimuksessa keskityttiin kahden geenin, typpioksidia tuottavan iNOS-entsyymin sekä tulehdusta vaimentavan tristetraproliinin, säätelyyn. Typpioksidi on elimistön signaalimolekyyli, joka säätelee immuunivastetta ja tuhoaa haitallisia bakteereita. Liiallisen typpioksidin tuoton tiedetään kuitenkin voimistavan tulehdusreaktiota ja sen tuotto on lisääntynyt mm. astmassa ja reumassa. Tristetraproliini puolestaan on tekijä, joka hajottaa tulehdusgeenien lähetti-RNA:ta ja estää näin tulehduksen välittäjäaineiden tuottoa. Tutkimuksessa havaittiin proteiinikinaasi C:n osallistuvan sekä iNOS- että tristetraproliinigeenin ilmentymisen säätelyyn. Proteiinikinaasi C:tä estävien yhdisteiden todettiin myös vähentävän typpioksidin tuottoa solumalleissa ja vaimentavan typpioksidivälitteistä tulehdusreaktiota in vivo tulehdusmallissa.

Väitöskirja tuotti uutta tietoa siitä, kuinka haitalliseksi muuttunutta tulehdusreaktiota voidaan säädellä proteiinikinaasi C:n kautta. Tutkimuksen tuloksia voidaan käyttää hyväksi kehitettäessä uusia lääkkeitä tulehdustautien hoitoon. Väitöskirja on tehty osana Tampereen yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan farmakologian yksikön laajempaa uusien tulehduslääkkeiden kehitysprojektia, jota johtaa professori Eeva Moilanen.

Inflammation is a defence mechanism by which the body reacts against foreign invaders and cell injuries. Activated inflammatory cells produce signalling molecules that regulate the inflammatory response and the progress of inflammation. Inflammation is usually beneficial, but if it is inadequately controlled or inappropriately directed e.g. against the body´s own tissues or harmless molecules, it may cause injury or disease. This is the case in some of the most common and disabling human diseases such as rheumatoid arthritis and asthma.

Protein kinase C (PKC) is a family of ten isoenzymes that are crucial in cellular signal transduction. Aberrant PKC activation has been demonstrated in several pathological states including cancer and metabolic disorders. Less is known about the specific effects of PKC isoenzymes on the regulation of inflammatory genes.

Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is one of the genes activated in inflammation. The enzyme for which it codes, iNOS, catalyses the production of nitric oxide (NO) from L-arginine and molecular oxygen in inflammatory cells such as macrophages. NO produced by iNOS has beneficial effects in innate immunity, where it functions as a toxic agent towards infectious organisms. However, aberrant iNOS induction seems to be involved in the pathophysiology of human diseases such as asthma, arthritis, and colitis.

Tristetraprolin (TTP) is a factor that can bind to AU-rich elements within the mRNAs of its target genes causing destabilization of the mRNA of several transiently expressed inflammatory genes such as TNFalpha, GM-CSF, and various interleukins. Studies with TTP knockout mice have shown that TTP deficiency evokes a profound inflammatory syndrome, which has been reported to be mainly due to excessive production of TNFalpha. TTP can be thought primarily as an anti-inflammatory or arthritis suppressor gene.

The overall aim of the present study was to investigate the role of PKC isoenzymes in the regulation of protein and mRNA expression of inflammatory genes iNOS and TTP. One aim was to identify which classical PKC isoenzymes are involved and whether the novel isoenzyme PKCdelta would take part in the regulation of iNOS or TTP under inflammatory conditions. Another major aim was to characterise the mechanisms involved in the regulation of iNOS and TTP expression by PKC isoenzymes.

Classical PKC isoenzymes were shown to participate in the regulation of the expression of iNOS and TTP. Inhibition of PKCbeta reduced the production of NO and decreased iNOS expression in activated macrophages. This effect seemed to be mediated mainly at the level of transcription, i.e. by affecting the activity of the transcription factor STAT1. PKCbetaII seemed to be able to also regulate the expression of TTP through the activation of transcription factor activator protein 2 (AP-2).

The novel isoenzyme PKCdelta was observed to take part in the regulation of iNOS protein and mRNA expression. Downregulation of PKCdelta by PKCdelta targeted siRNA or inhibition of PKCdelta by rottlerin reduced iNOS expression, most likely through the downregulation of transcription factor interferon response factor 1 (IRF1). PKCdelta is believed to be a significant inflammatory pathway also in vivo, because inhibition of PKCdelta by rottlerin showed anti-inflammatory effects in carrageenan-induced inflammation, as did treatment with an iNOS inhibitor L-NIL. PKCdelta seemed to be able to regulate also the expression of TTP by affecting TTP mRNA decay.

Inflammation leads to the activation of PKC signalling pathways and the production of many inflammatory factors, e.g. iNOS, which further enhance the inflammatory process. During inflammation, iNOS produces large amounts of NO, which in addition to its antimicrobial effects, possesses regulatory and proinflammatory/destructive effects. Compounds that inhibit iNOS expression or activity have been claimed to have anti-inflammatory properties in various forms of experimentally induced inflammation. Here, inhibition of iNOS expression was found after inhibition of PKCbeta and PKCdelta suggesting that those two PKC isoenzymes can enhance the inflammatory reaction by upregulating iNOS expression. In the normal inflammatory reaction, also the factors that limit the inflammatory process become activated. One of these factors is TTP, the expression of which was also found to be regulated by PKC in a pathophysiologically relevant manner.

In the present study, the role of different PKC isoenzymes in the regulation of inflammatory genes iNOS and TTP were identified. Novel mechanisms of regulation by PKC isoenzymes were discovered. These findings add to our understanding of the inflammatory process and this information may be useful in the development of novel anti-inflammatory drugs.