Structural and Functional Characterization of Engineered Avidin Proteins

Abstract

Proteiinit ovat biologisia makromolekyylejä, jotka koostuvat peptidisidosten avulla toisiinsa kiinnitetyistä aminohappotähteistä. Niiden järjestys puolestaan määräytyy perintöaineksen DNA:n sisältämästä geneettisestä tiedosta. Lineaarinen proteiiniketju laskostuu itsestään tai muiden proteiinien opastuksella, eli muodostaa oikean kolmiulotteisen rakenteen. Lopullinen kolmiulotteinen muoto vakaantuu heikkojen kemiallisten vuorovaikutusten avulla, jolloin saadaan oikean toiminnan vaatima rakenne. Proteiinien sanotaankin olevan solujen päätoimijoita ja huolehtivan geenien määräämistä tehtävistä. Monien proteiinin toimiminen edellyttää, että se pystyy sitomaan muita molekyylejä spesifisesti ja tarpeeksi tiukasti.

Avidiini on kananmunan valkuaisen proteiini, jonka tehtävä on sitoa H-vitamiinia. Avidiinin uskotaan estävän mikro-organismien kasvua munassa ja toimivan siten puolustusproteiinina. H-vitamiini tunnetaan myös biotiini-nimellä ja avidiinin kyky sitoa tätä vitamiinia on harvinaisen vahva. Vahvan sitoutumisen vuoksi avidiinia ja sen bakteerista löydettyä vastinetta, streptavidiinia, käytetään useissa bio- ja lääketieteen sekä nanoteknologian sovellutuksissa.

Avidiini on hyvin kestävä proteiini. Eräiden kanan avidiinin kaltaisten geenien koodaamien AVR proteiinien lämmönkestävyys on kuitenkin hyvinkin erilainen ja esimerkiksi AVR4 proteiini säilyy toimintakykyisenä korkeammassa lämpötilassa kuin avidiini. Rakenteellisia ja aminohappotähteiden eroja tutkimalla pyrittiin löytämään syitä tähän parempaan lämmönkestävyyteen. Kohdennetun mutageneesin, eli harkitun geneettisen tiedon muuttamisen, avulla pystyttiin muokkaamaan avidiinia siten, että sen lämmönkestävyys parani huomattavasti. Proteiini nimettiin kimeeriseksi avidiiniksi kreikan mytologiasta otettua "kimera" termiä käyttäen. Tämä kimeerinen avidiini säilyttää sitomiskykynsä, vaikka sitä kuumennettaisiin yli 100 °C lämpötilassa tai sitä pidettäisiin erilaisissa orgaanisissa liuottimissa. Proteiinin erinomainen kestävyys mahdollistaa sen käytön täysin uusissa sovellutuksissa, joissa paljon käytetyt kanan avidiini tai bakteerin streptavidiini hajoaisivat.

Tutkimuksen toisessa osassa tutkittiin voidaanko avidiinin biotiinin sitomistaskua muokata kohdennetun mutageneesin avulla niin, että sen sitomisominaisuuksia biotiinia ja toista pientä HABA nimistä molekyyliä kohtaan voitaisiin muuttaa. Poistamalla biotiinin sitoutumiselle tärkeä pintarakenne, sekä muuttamalla yksi aminohappotähde toiseksi, pystyttiin muokatun avidiinin suhteellista biotiinin ja HABA-molekyylin välistä sitomiskykyä muuttamaan villi tyypin avidiiniin nähden yli miljardi-kertaisesti.

Väitöskirjatyön kolmannessa osassa pyrittiin selvittämään kananmunan keltuaisessa esiintyvän biotiinia sitovan proteiinin (BBP-A) ominaisuuksia. Proteiinin rakenne ja sitoutumista tutkivat kokeet paljastivat, että BBP-A sitoo tiukasti paitsi biotiinia, myös aikaisemmin tutkimatonta sitä rakenteellisesti muistuttavaa molekyyliä, biotiiniulfoksidia. Proteiini muistuttaa rakenteeltaan avidiinia, mutta on lämmönkestävyydeltään ja sitomisominaisuuksiltaan erilainen.

Kokonaisuudessaan tämä monitieteellinen tutkimus selventää avidiinin ja sen kaltaisten proteiinien pienmolekyylien sitoutumiseen vaikuttavia tekijöitä ja lisää siten tietoa avidiinin rakenteen ja toiminnan välisistä suhteista. Avidiini-biotiini rakenne on erittäin monikäyttöinen työkalu, jota käytetään hyväksi lukuisissa erilaisissa bioteknologian, diagnostiikan ja lääketieteen sovellutuksissa joiden markkina-arvo on huomattava. Väitöskirjassa esitettyjä havaintoja voidaan tulevaisuudessa hyödyntää uusien avidiini-biotiini teknologian sovelluksien kehittämiseen tai parantamaan olemassa olevia.

Avidin was first found in chicken, but is now known to be present in the avian egg-whites or egg-jellies. Avidin is thought to work as a defensive agent in the egg preventing the growth of unwanted organisms by creating a biotin drain. It binds its natural ligand, biotin, with very tight affinity. The determinants of this tight binding have been solved with the 3D structure of the avidin-biotin complex. It revealed that there are several hydrogen bonds between the avidin and biotin molecules and that the shape of the binding pocket is well optimized for biotin. Due to their tight affinity to biotin and good stability, avidin and its bacterial analogue streptavidin, have been used in a wide range of applications in biosciences. Collectively, applications based on avidin or streptavidin are referred to as strept(avidin)-biotin technology.

The aim of this study was to develop engineered forms of avidin and to characterise their properties. Avidin related proteins 1-7 (AVRs) belong to the avidin protein family. Their properties differ from each other and interestingly AVR4/5 was previously found to be more thermostable than avidin. To study the structural reasons behind the high thermostability of AVR4/5, we used genetic engineering to transfer parts of the sequence of AVR4/5 to avidin. As a result, we produced the chimeric avidin Ile117Tyr mutant (ChiAVD(I117Y)), the most thermostable avidin so far. Furthermore, we wanted to see if the high thermal stability of chimeric avidin correlated with stability in harsh organic solvents. Chimeric avidin was found equal or superior in stability when compared to avidin or streptavidin in most of the conditions studied. Therefore, chimeric avidin may prove useful in applications where high stability is required.

The loop region between the ?-strands 3 and 4 (L3,4) of avidin is important for ligand binding. This region was removed by circular permutation and the properties of the resulting deletion mutant were then compared to those of wild type avidin. The deletion of L3,4 combined with the point mutation Asp118Met (cp4?3(N118M)) reduced biotin binding affinity and increased affinity to 4?-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid (HABA). Based on isothermal titration calorimetry (ITC) analysis the relative HABA/biotin binding affinity of cp4?3(N118M) increased over a billion fold (109) when compared to that of wt avidin.

The third part of the study aimed at characterising the structure and properties of a novel chicken biotin-binding protein A (BBP-A). The structure of the protein in complex with the ligand revealed that the ligand-binding site was occupied by d-biotin d-sulfoxide (BSO). ITC analysis confirmed that BBP-A binds both BTN and BSO with comparable affinities, a property unique among avidins. The structure of the protein resembles that of avidin, but its thermostability is lower.

In summary, this multidisciplinary study clarified factors affecting the ligand-binding properties of avidin and novel avidin-like proteins, and therefore, increased the knowledge of the structure-function relationship of avidins. Furthermore, this work may offer new tools for avidin-biotin technology.