Human embryonic stem cell-derived neural and neuronal cells in vitro and in vivo: treatment of experimental cerebral ischemia

Abstract

Aivoverenkiertohäiriöt ovat kolmanneksi yleisin kuolinsyy ja yleisin pitkäaikaisen invaliditeetin aiheuttaja teollistuneissa maissa. Nykyään yli 14 000 ihmistä Suomessa ja 850 000 ihmistä Euroopassa sairastuu aivoverenkiertohäiriöön vuosittain. Väestön vanhetessa ja esimerkiksi verisuonitautien yleistyessä uusien potilaiden määrän on ennustettu jopa kaksinkertaistuvan seuraavan 10 vuoden aikana. Nykyiset hoidot, liuotushoito ja kuntoutus, eivät ole tarpeeksi tehokkaita sillä niistä huolimatta useille potilaille jää pysyviä toimintahäiriöitä aivovaurioiden seurauksena. Tämän vuoksi aivoverenkiertohäiriöt muodostavat yhteiskunnalle kasvavan taloudellisen taakan potilaiden ja heidän läheistensä elämänlaadun heikkenemisestä puhumattakaan.

Jatkuvasti tutkimuksen alla olevien hermosoluja suojaavien lääkeaineterapioiden lisäksi aivoverenkiertohäiriöiden hoidoksi on ehdotettu solusiirrännäisiä. Istutetut solut voisivat korvata aivoverenkiertohäiriön seurauksena kuolleet hermo- ja hermotukisolut niin rakenteellisesti kuin toiminnallisestikin palauttaen näin aivojen normaalin toiminnan. Erilaisia solusiirrännäisiä on tutkittu sekä eläinmalleissa että muutamissa kliinisissä kokeissa. Yksi potentiaalinen lähtömateriaali solusiirrännäisiin on alkion kantasolut. Ne ovat kaikkein erilaistumiskykyisimpiä soluja, jotka voivat jakaantua käytännössä rajattomasti ja edelleen erilaistua miksi tahansa elimistön solutyypeistä. Näistä soluista voidaan tuottaa suuria määriä esihermosoluja tai hermosoluja ja hermotukisoluja, joita voidaan edelleen testata aivoverenkiertohäiriöiden hoidossa.

Tämän väitöskirjan tavoitteena oli kehittää yksinkertainen menetelmä tehokkaaseen nuorien hermosolujen tuottoon ihmisalkion kantasoluista. Tuotettuja hermosoluja testattiin edelleen uudessa vasta-ainepohjaisessa kasvatusalustassa ja niiden sähköistä toiminnallisuutta tutkittiin laajasti. Lisäksi solujen vaikutusta tutkittiin kokeellisessa aivoverenkiertohäiriössä. Koe-eläinmalleissa tutkittiin parasta tapaa toimittaa istutettavat solut aivoihin vaurioalueelle sekä hermosolusiirteiden vaikutusta toiminnalliseen kuntoutumiseen aivoinfarktin jälkeen. Lisäksi tutkittiin siirrettyjen solujen selviäminen, vaeltaminen sekä erilaistuminen kohdekudoksessa.

Tutkimuksessa kävi ilmi, että ihmisalkion kantasoluista voidaan yksinkertaisella menetelmällä tuottaa puhtaita hermosolupopulaatioita, mutta alkion kantasolulinjoilla on linjakohtaisia eroja erilaistumistehokkuudessa. Tuotetut hermosolut pystyivät muodostamaan hermoverkkoja, jotka osoittivat sähköistä aktiivisuutta ja sen kypsymistä ajan kuluessa. Kehitetty vasta-ainepinta osoittautui hermosoluspesifiseksi kasvatusalustaksi. Eläinkokeissa havaittiin, että suonensisäinen soluinjektio ei ole toimiva menetelmä solujen toimittamiseksi aivoihin; solut kerääntyivät maksaan, munuaisiin ja haimaan. Toisessa kokeessa hermosolut istutettiin suoraan standardi- tai rikastetussa ympäristössä elävien rottien halvaantuneeseen aivokudokseen, ja niiden vaikutusta toiminnalliseen kuntoutumiseen seurattiin kahden kuukauden ajan. Ympäristöstä riippumatta solusiirteen saaneet rotat toipuivat huomattavasti nopeammin yhdessä käyttäytymistestissä ensimmäisen kuukauden aikana, mutta hienomotoriikkaa vaativassa testissä eroa ei havaittu. Solujen selviäminen aivokudoksessa oli vähäistä.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että ihmisalkion kantasolujen erilaistaminen hermosoluiksi onnistuu, mutta solulinjojen välillä olevat erot erilaistumistehokkuudessa on otettava huomioon. Lisäksi tuotettujen hermosolujen sähköinen toiminnallisuus pitäisi aina osoittaa. Vasta-ainepintojen käyttö voisi mahdollisesti olla hyvä keino hermosolujen kasvatukselle. Käytännössä vaikuttaa siltä, että solusiirteitä ei voida toimittaa aivoihin suonensisäisin injektioin ja vaikka siirretyillä hermosoluilla saavutetaan toiminnallista kuntoutumista, on vielä tehtävä lisää työtä sen eteen, että solut selviytyisivät paremmin kohdekudoksessa.

Human pluripotent stem cells and their neural derivatives are considered potential regenerative material for treating central nervous system deficits resulting from traumatic injury (e.g. spinal cord injury) or neurodegenerative disease (e.g. ischemic stroke, multiple sclerosis, Parkinson s disease). Although several studies have examined stem cell transplantation as a treatment for these conditions, the results have been highly variable and much more work is needed to address the many remaining questions. Clinical applications for neural cell transplants are currently being designed to treat brain injuries resulting from stroke and spinal cord injury.

This thesis describes efforts towards the generation of an efficient and simple protocol to differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into neural progenitors and young neuronal cells. Additionally, a neuron-specific culturing matrix has been designed to improve the maintanence and differentiation of neural progenitors. The electrophysiologic properties of neuronal networks were also investigated in vitro. In addition, neural progenitor cell transplantation was performed in animal models of stroke and evaluated with regard to the optimal transplantation route and their effects on functional recovery of animals in combination with rehabilitation, i.e. housing in an enriched environment.

Neural differentiation of hESCs was achieved with a relatively simple differentiation protocol that was assessed using molecular biological methods. A hESC line-dependent variation in differentiation efficacy was observed. Regardless of the hESC line used, neuronal cells that were produced formed functional electrically active networks in vitro. Thus, the method developed in this thesis clearly produces functional neuronal cells. Moreover, neural adhesion molecule antibodies effectively produced a specific surface matrix for the selection of neuronal cultures. In animal studies, the optimal delivery route to induce the accumulation of transplanted neural progenitor cells into damaged brain tissue was evaluated. The non-invasiveness of intravenous administration of cell grafts would be optimal for a clinical setting. Based on our findings that grafted neural progenitor cells accumulated mainly in the liver, kidneys, and spleen following intravenous administration, this method appears to be not effective. We also attempted intracerebral transplantation of the neural progenitor cells into rats with experimentally induced stroke that were housed in either an enriched environment or standard cages. Regardless of the type of housing, rats with neural progenitor cell transplants showed significant improvement in a postural support task during the first month after treatment when compared to vehicle-treated animals. Neither group of rats showed any improvement in a reaching task. In vivo cell survival was minimal.

In conclusion, hESCs can be efficiently differentiated into neural progenitors and neuronal cells, but hESC line-dependent variations in differentiation potential must be considered, especially when planning and designing clinical applications. In addition, the electrophysiologic properties of the produced neuronal cells and networks should be carefully studied in vitro to ensure the functionality of the neurons. Neuron-specific antibodies can be used as a selective culturing matrix for neuronal cells. Intravenous transplantation of the cell grafts into the ischemic brain is currently not feasible and more work is needed to enhance the efficacy of intracerebrally transplanted cells.