Mutational effects on protein structures: Knowledge gained from databases, predictions and protein models

Abstract

Valkuaisaineet eli proteiinit ovat välttämättömiä elämää ylläpitäviä molekyylejä. Kaikkien proteiinien rakennusohjeet ovat perimässä ja ne rakentuvat 20 erilaisesta aminohaposta, joiden ominaisuudet ja järjestys määrittelevät proteiinin kolmiulotteisen rakenteen ja tehtävän. Yhden aminohapon muutokset voivat johtaa eriasteisiin muutoksiin proteiinin rakenteessa ja/tai toiminnassa. Äärimmäisessä tapauksessa yhden aminohapon muutos voi ilmetä vakavana sairautena. Proteiinin kolmiulotteisen rakenteen avulla mutaatioista aiheutuvia rakenteellisia muutoksia voidaan tutkia.

Tässä bioinformatiikan alaan kuuluvassa väitöskirjatyössä tehtiin laaja-alainen kartoitus tautia aiheuttavien pistemutaatioiden kohdentumisesta proteiinin paikallisesti esiintyvillä, säännöllisillä alueilla, joita kutsutaan proteiinin sekundäärirakenteiksi. Tutkimusaineisto sisälsi runsaasti sairauksia aiheuttavia missense-mutaatioita kymmenissä eri proteiineissa. 80% mutaatioista esiintyi sekundäärirakenteissa. Aminohappojen tiedetään jakautuvan eri tavalla eri sekundäärirakennetyypeissä. Tutkimus osoitti, että aminohapot, joiden mutaatiot aiheuttavat sairauden, eivät noudata tätä jakaumaa, vaan tietyt aminohapot mutatoituvat muita useammin rakennetyypistä riippuen ja korvautuvat yleensä ominaisuuksiltaan hyvin erityyppisellä aminohapolla. Yli puolella mutanttiaminohapoista havaittiin proteiinin stabiilisuuteen vaikuttavia ominaisuuksia. Proteiinit toimivat normaalisti hyvin pienellä stabiilisuusalueella ja pistemutaation aiheuttama siirtymä tältä alueelta johtaa yleensä proteiinin toimimattomuuteen. Stabiilisuuden heikkenemistä tai vahvistumista voidaan mitata kokeellisesti, mutta menetelmät ovat yleensä työläitä eivätkä yleensä sovellu suurille mutaatioaineistoille. Tässä väitöskirjatyössä tehtiin stabiilisuusmuutoksia ennustavien ohjelmien vertaileva tutkimus, jossa käytettiin testiaineistona kokeellista mittausaineistoa. Tulokset osoittivat, että ohjelmat eivät pysty tuottamaan kovin luotettavia tuloksia jos mutaatiovaikutuksesta ei ole aiempaa tietoa. Sen sijaan ohjelmat menestyivät paremmin, kun ne ennustivat stabiilisuutta heikentäviä ja vahvistavia mutaatioita erikseen. Jos ohjelmia halutaan käyttää tautimekanismien selvittämiseen, merkittävästi parempia menetelmiä tarvittaisiin.

Kokeellisesti määritettyjä kolmiulotteisia proteiinirakenteita ei ole tällä hetkellä saatavilla kuin pienelle osalle tunnettuja proteiineja johtuen mm. määrityksen haastavuudesta. Rakennemalliennusteita voidaan tehdä joko suoraan aminohappoketjusta lähtien tai käyttämällä mallina tunnettua, samankaltaista sukulaisproteiinia, jolloin puhutaan vertailevasta eli homologiamallinnuksesta. Rakennemalleja on käytetty mm. pistemutaatioiden vaikutusmekanismien tunnistamiseen ja ennustamiseen. Tässä työssä tarkoituksena oli arvioida mikäli homologiamallit ovat riittävän tarkkoja luotettavaan biologisten ilmiöiden tarkasteluun. Työssä käytetyt 14 rakennemallia oli tuotettu homologiamallinnuksen avulla kahden vuosikymmenen aikana samassa tutkimustyhmässä, jossa tämä tutkimus suoritettiin ja jokainen malli ja sen pohjalta tehdyt ennusteet oli julkaistu. Tutkimuksessa voitiin osoittaa, että vaikka samankaltaisuus käytetyn mallirakenteen kanssa oli hyvin alhainenkin (alle 30%), rakennemalleihin pohjautuvat ennusteet olivat sopusoinnussa kokeellisesta aineistosta saatujen tulkintojen kanssa.

Tutkimuksen avulla saatiin uutta tietoa sairauksia aiheuttavien mutaatioiden luonteesta ja vaikutusmekanismeista proteiinirakenteessa sekä tietoa mutaatiovaikutusten ennustamiseen käytettyjen työkalujen käyttökelpoisuudesta mutaatiotutkimuksessa. Ohjelmien käytettävyyden analyysistä saatuja tuloksia voidaan hyödyntää ennustusmenetelmien kehittämisessä.

Proteins are the machinery of life. They take care of the functionality of living cells and interactions between cells. Proteins are formed by amino acids whose properties and interactions take part in protein folding and maintain protein stability during the function of the protein. Missense mutations that are one amino acid substitution can have an effect on energies stabilizing the protein and thus have an effect of a different degree on protein structure and/or function. In extreme cases one amino acid change can lead to a severe disease phenotype. In order to investigate structural effects due to mutations structural information is needed.

One aim of the study was to investigate disease-causing mutations in protein secondary structures. For this purpose mutation data from various mutation databases was combined with experimental structural data. The dataset contained 2413 disease-causing missense mutations in 44 proteins. 80% of the mutations appeared in secondary structures. Amino acids are known to have preferences when it comes to different secondary structure types (α-helix, β-sheet, turn, and bend). The study indicated that disease-causing missense mutations do not follow this distribution but that certain amino acids mutate more often depending on the secondary structure type, and that they are often substituted with amino acids with very different properties. In over half of the mutation cases a direct connection to protein stability could be observed. The effects of amino acid substitutions on protein stability can be predicted computationally with stability prediction programs. The performance and accuracy of nine of these programs was assessed using experimental data for 1784 missense mutations as a test set. All the tested stability predictors showed a coherent trend in their predictions which was in line with experimental data. However, the programs tend to fail in predicting neutral mutations. Programs succeed better when considering their ability to predict stability increasing or decreasing mutations separately. As a result programs could be ranked albeit different programs succeeded better than others when considering different parameters.

In the absence of experimental 3D data the alterations in stabilizing interactions can be studied using protein models. Protein models obtained with homology modeling have been widely used to interpret biological phenomena such as alterations in intramolecular energies due to mutations. The aim of the study was to evaluate if models are accurate enough to be used to predict biological phenomena reliably. The 14 homology models used in this study were modeled during the last two decades in-house and each of them had been published along with predictions based on them. The study showed that the biological explanations made based on models with even very low sequence identity (less than 30%) with the template, were in concordance with the interpretations made based on experimental structures and other experimental studies. This analysis indicates that models, when made carefully, can be used to make biological predictions of mutation consequences.