HIV-1 Nef protein and the Nef-associating kinase PAK2 in cell signaling

Abstract

HIV- eli immuunikatovirustartuntaa kantaa maailmassa arviolta yli 30 miljoonaa ihmistä. Suomessa ilmoituksia HIV-positiivisista henkilöistä oli vuoden 2010 alkuun mennessä kirjattu runsas kolme tuhatta, ja määrä on viime vuosina lisääntynyt noin kahdellasadalla HIV-potilaalla vuosittain. Vaikka HIV:n lääkehoito on viime vuosina kehittynyt merkittävästi ja sairauden etenemistä pystytään tehokkaasti hidastamaan, ei virusta kuitenkaan pystytä nykyisillä lääkkeillä häätämään elimistöstä kokonaan. HIV infektoi pääasiassa ihmisen immuunijärjestelmän kannalta keskeisiä CD4(+) T-soluja sekä makrofageja. Lisääntyessään virus pystyy myös sekä suoraan että epäsuorasti tuhoamaan CD4(+) T-soluja eli auttajalymfosyyttejä. Tämän seurauksena on potilaan immuunipuolustuksen vähittäinen heikkeneminen ja HIV-infektion kehittyminen varsinaiseen AIDS-vaiheeseen, sekä useat siihen liittyvät sairaudet kuten kasvaimet ja muut tulehdukset.

Nef on yksi HI-viruksen tuottamista virusproteiineista, ja keskeinen tekijä HIV-infektion kehittymiselle. Useat Nef-proteiinin toiminnot edistävät viruksen selviytymistä ja lisääntymistä potilaan elimistössä, ja infektion etenemisen onkin havaittu hidastuvan viallisen tai puuttuvan Nef-proteiinin seurauksena sekä luonnollisen HIV-infektion yhteydessä ihmisellä että kokeellisen SIV-infektion yhteydessä rhesusapinoilla. Nef ei itsessään ole entsymaattisesti aktiivinen proteiini, mutta sen kyky sitoutua solun omiin proteiineihin ja vaikuttaa niiden toimintaan selittää Nef:n vaikutusten laajan kirjon. Yksi tunnetuista Nef:iin sitoutuvista soluproteiineista on p21-aktivoituva kinaasi 2 (PAK2). Tämän työn tarkoituksena on ollut selvittää Nef/PAK2-kompleksin muodostumiseen vaikuttavia tekijöitä molekyylitasolla, sekä tämän kompleksin toimintaa solunsisäisessä viestinnässä. Tutkimuksessa kuvattiin uusi signalointimekanismi, joka mahdollistaa PAK2:n voimakkaan aktivoitumisen yhdistämällä kaksi viestintäreittiä. Molekyylibiologisia menetelmiä käyttäen tutkittiin myös PAK2:n aktivaatioon liittyvien proteiinin rakenteellisten muutosten, pienten GTPaasi-proteiinien sekä PAK2 kinaasin oman entsymaattisen aktiivisuuden merkitystä Nef/PAK2-kompleksin muodostumiselle. Proteiinikompleksin solunsisäistä sijaintia tutkittaessa sen havaittiin lokalisoituvan solussa tietyille, soluviestinnän kannalta keskeisille solukalvon ns. lipidilautta-alueille. GTPaaseja aktivoivan Vav1-proteiinin havaittiin osallistuvan Nef/PAK2-kompleksin muodostumiseen sekä kompleksin kulkeutumiseen solun kalvorakenteisiin. Lisäksi työssä tutkittiin Nef-molekyylin oletettua dimerisaatiopintaa, jonka vastakkaisesti varautuneilla aminohapoilla havaittiin olevan oleellinen merkitys Nef-Nef dimeerin muodostumiselle, jonka puolestaan todettiin olevan edellytys Nef/PAK2-kompleksin muodostumiselle sekä Nef:n välittämän HIV-partikkeleiden infektiivisyyden lisääntymiselle.

Tulokset antavat uutta tietoa siitä, kuinka HIV käyttää solun omia signalointireittejä hyväkseen. HIV-1 Nef-proteiinin toiminnan kannalta tärkeiden vuorovaikutusten ymmärtäminen tarjoaa uusia hyödyntämismahdollisuuksia kohdennetulle lääkekehitykselle.

Nef is an accessory protein encoded by the human and simian immunodeficiency viruses (HIV/SIV) and is a major factor in promoting viral pathogenesis. Several cellular functions of Nef, including downregulation of the surface molecules CD4 and MHC I, increase in viral infectivity, and Nef-mediated effects on intracellular signaling favor survival and propagation of the virus. Nef does not possess any intrinsic enzymatic activity; instead, it functions by interacting with a number of endogenous proteins within the host cell.

One of the well-characterized Nef-associating protein partners and a central molecule in this study is p21-associating kinase 2 (PAK2). Previously, association of the HIV-1 Nef with PAK2 has been proposed to play a role in T cell activation, viral replication, apoptosis and progression of HIV infection to AIDS. Despite intense research, there is no consensus on the relevance of Nef-PAK2 association and its function in virus pathogenesis. Furthermore, selective association of Nef with a minute but highly active subpopulation of total cellular PAK2 has raised questions on the molecular requirements of Nef-PAK2 association. This work elucidated the interplay of Nef and PAK2 in cellular signaling by studying the mechanism of PAK2 activation and its role in Nef association. To clarify the role of additional proteins during Nef-PAK2 complex formation, the involvement of p21-GTPases and guanine nucleotide exchange factor (GEF) proteins was studied. Finally, the functional role of charge distribution within the putative Nef interaction surface was characterized.

Here, we describe a new signaling pathway that potentiates PAK2 activation by converging signal transduction via Src tyrosine kinases with p21-GTPase-induced PAK activation. The p21-GTPase-induced conformational opening of PAK2 was associated with the ability of PAK2 to interact with Nef, and their association was stabilized by reduced kinase activity. The Nef-PAK2 (NAK) complex was specifically localized to detergent-resistant membranes (DRM), and Vav1 was identified as a GEF component of Nef-PAK2 complex, recruited to the DRMs by Nef. The reciprocal charges present at the putative dimer interface (PDI) of Nef were indispensable for Nef-dependent increase in viral infectivity. In addition, several other Nef activities, including NAK association, membrane localization, and activation of Hck were coordinated by charged residues at the Nef PDI.

In conclusion, our results provide new insight on the cellular signaling upstream of Nef-PAK2 association, as well as on the molecular domains and binding partners that are important for the formation of the Nef-PAK2 complex. In addition, our data elucidate how Nef functions are related to charge distribution at the PDI surface. Detailed knowledge on the molecular mechanisms involved in Nef-PAK2-mediated signaling may provide clues for potential target sites that can be used to develop HIV inhibitory drugs.