Gene expression profiling of human lipoprotein-loaded macrophages and atherosclerotic lesions with special emphasis on ADAMs

Abstract

Ateroskleroosi on monitekijäinen sairaus, jonka kehittymiseen vaikuttavat perimä ja ympäristötekijät. Sairaus aiheuttaa vuosikymmenien saatossa valtimoiden tukkeutumista, mikä johtaa verenkiertohäiriöihin sydämessä, aivoissa ja alaraajoissa. Koska plasman korkea LDL- (low-density lipoprotein) kolesterolipitoisuus on ateroskleroosin huomattavimpia riskitekijöitä, on ateroskleroosin uskottu johtuvan pääasiallisesti rasva-aineiden kerääntymisestä verisuonen seinämään. Nykykäsityksen mukaan ateroskleroosia voidaan kuitenkin tarkastella kroonisena tulehdussairautena, jonka etenemisessä etenkin hapettuneilla lipoproteiineilla, monosyyteistä erilaistuneilla makrofageilla ja T-soluilla on merkittävä rooli. Ateroskleroosin syntymiseen ja etenemiseen vaikuttavia tekijöitä voidaan tutkia selvittämällä sairaudessa ilmentyviä geenejä tai usean geenin muodostamia aineenvaihduntateitä.

Tässä väitöskirjatyössä pyrittiin löytämään geenejä, jotka vaikuttavat ateroskleroosin syntymiseen ja kehittymiseen. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään ateroskleroosin alkuvaiheen verisuonimuutoksiin liittyviä geenejä tutkimalla ihmisen monosyytti-makrofagien geenien ilmentymisen muuttumista altistettaessa niitä normaaleille ja hapettuneille LDL- ja HDL- (high-density lipoprotein) hiukkasille. Tutkimuksessa havaittiin hapettuneiden LDL- ja HDL-hiukkasten vaikutuksen olevan pääasiallisesti vastakkainen monosyytti-makrofagien geenien ilmentymiseen, vaikkakin huomattava osa geeneistä ilmentyi samansuuntaisesti lipoproteiinikäsittelyiden jälkeen. Elimistössä myös HDL-hiukkaset ovat alttiita hapettumiselle, joten tutkimuksen perusteella myös hapettuneet HDL-hiukkaset voivat myötävaikuttaa ateroskleroosin kehittymiseen. Tutkimuksessa havaittiin useita uusia ateroskleroosin varhaisvaiheisiin mahdollisesti liittyviä geenejä, joita ei oltu aikaisemmin liitetty ateroskleroosiin.

Soluviljelykokeiden lisäksi tutkimuksessa kartoitettiin ihmisten kaikkien geenien ilmentyminen ateroskleroottisissa kaula-, reisi- ja aortta-valtimoissa sekä terveissä rintakehän seinämävaltimoissa ja pyrittiin löytämään geenejä, jotka osallistuvat pidemmälle edenneen ateroskleroottisen vaurion kehittymiseen. Tutkimuksessa selvitettiin ateroskleroottisissa valtimoissa eniten ja vähiten ilmentyvät yksittäiset geenit, sairaudessa muuntuneet geenien toiminnalliset kokonaisuudet ja aineenvaihduntatiet, sekä karakterisoitiin kullekin ateroskleroottisille valtimoille ominaiset geenien ilmentymisen muutokset. Koko perimän laajuisia geenien ilmentymisen tutkimuksia on tehty aikaisemminkin, mutta tässä tutkimuksessa selvitettiin ensimmäistä kertaa kolmessa ateroskleroottisessa valtimossa ilmentyvät geenit sekä kuvattiin yksittäisiä geenejä, jotka ovat aktiivisena ainoastaan tietyn valtimon ateroskleroosissa. Koska ateroskleroosi on sairaus, johon osallistuu kymmeniä, ellei satoja geenejä, auttavat tutkimuksessa selvitetyt ateroskleoottisissa valtimoissa muuntuneet aineenvaihduntatiet ymmärtämään kokonaisvaltaisesti ateroskleroosin kehittymistä. Tutkimuksessa havaittiin myös yksittäisiä geenejä, joiden ilmentymisen havaittiin muuttuneen ainoastaan ateroskleroottisessa aortta- tai reisivaltimossa. Tälläisten kullekin ateroskleroottiselle valtimolle ominaisten geenien selvittäminen auttaa ymmärtämään näihin valtimoihin kehittyvän sairauden erityispiirteitä.

Tutkittaessa kaikkien ihmisten geenien ilmentymistä ateroskleroottisissa valtimoissa, havaittiin ADAM- (A Disintegrin And Metalloprotease) metalloproteaasien ilmentymisen muuttuneen sairaissa valtimoissa verrattuna terveisiin valtimoihin. Tutkimuksessa havaittiin ADAM8, -9, -15 ja -17 mRNA:n ja proteiinien määrän lisääntyneen ateroskleroottisissa vaurioissa ja ADAM8 geenivariaation liittyvän komplisoituneiden ateroskleroottisten vaurioiden pinta-alaan ja sydänäkkikuolemaan. ADAM-metalloproteaasien yhteyttä ateroskleroosin on tutkittu maailmalla vähän ja tulos ADAM8:n yhteydestä ateroskleroosin on uusi. Koska ADAM-metalloproteaaseilla on useita ateroskleroosin kannalta mielenkiintoisia ominaisuuksia, esimerkiksi sytokiinien ja kasvutekijöiden aktivointi tai inaktivointi, voi lisääntynyt ADAM-metalloproteaasien ilmentyminen ateroskleroosissa vaikuttaa huomattavasti sairaudelle tyypillisen tulehdusprosessin etenemiseen.

Atherosclerosis is the most important cause of cardiovascular diseases and globally, the major cause of death. Generally, atherosclerosis can be considered to be a form of chronic inflammation resulting from interaction between modified lipoproteins, monocyte-derived macrophages, T cells, and the normal cellular elements of the arterial wall.

The objectives of the thesis were to 1) study the gene expression changes induced by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) and oxidized high-density lipoprotein (ox-HDL) molecules in cultured human monocyte-macrophages, 2) study the gene expression changes that prevail in advanced human atherosclerotic arteries, 3) define the expression of ADAM8 mRNA and protein in atherosclerotic arteries and study if there is an association of its 2662 T/G allelic variant (rs2995300) with atherosclerosis and myocardial infarction (MI) and 4) define the expression of ADAM9, -15 and -17 mRNA and protein in human atherosclerotic plaques and identify their catalytically active forms in the plaques.

The gene expression changes characterizing early atherosclerotic lesion formation were studied with cDNA microarray and quantitative RT-PCR (QRT-PCR) using cultured human monocyte-macrophages obtained from leukocyte-rich buffy coats collected from healthy blood donors. The Tampere Vascular Study (TVS) material was used to evaluate the gene expression changes prevailing in advanced human atherosclerotic arteries using genome-wide oligonucleotide array. The TVS study material consisted altogether of 24 atherosclerotic arteries and six non atherosclerotic control arteries. Atherosclerotic arteries were collected from carotid and femoral arteries as well as abdominal aortas. Internal thoracic arteries were used as controls. Gene expression changes were verified with QRT-PCR and the localization of the ADAM proteins studied was studied with immunohistochemistry. The association of ADAM8 allelic variant with atherosclerosis and MI was analyzed with TaqMan 5´exonuclease assay and fluorescent allele-specific TagMan probes using the Helsinki Sudden Death Study (HSDS) material.

1) Ox-LDL and ox-HDL significantly affected the gene expression profiles of monocyte-macrophages. Lipoprotein treatments (LDL vs. HDL) mainly induced opposite expression in the gene expression of monocyte-macrophages but in addition, a significant number of genes was found to respond similarly to lipoprotein treatments. Several new candidate genes for foam cell formation were found. 2) Using genome-wide gene expression array (GWEA), we characterized the generally most up- and down-regulated genes in atherosclerotic plaques and found eight genes specific for aortic plaques and three genes for femoral plaques. In addition, a total of 28 pathways dysregulated (20 up- and 8 down-regulated compared to non-atherosclerotic controls) in plaques were defined with special emphasis on a T cell chemokine pathway. 3-4) The expression of ADAM8, -9, -15 and -17 were found to be significantly induced in the atherosclerotic plaques and the allelic variant of ADAM8 (rs2995300) was significantly associated with the area of complicated atherosclerotic plaques and fatal MI in HSDS material.

Microarray technology was found to be applicable in the screening of gene expression changes in lipoprotein-loaded monocyte-macrophages as well as in advanced human atherosclerotic arteries. Several novel candidate genes and pathways potentially involved in the development of atherosclerosis were found. The pronounced expression of ADAM8, -9, -15, and -17 in the atherosclerotic plaque and the association of ADAM8 allelic variant with the areas of complicated atherosclerotic plaques and fatal myocardial infarct support the involvement of ADAMs in atherosclerosis.