Characterization and optimization of in vitro culture conditions of adult stem cells for clinical cell therapy

Abstract

Rasva- ja hammaskudos ovat mielenkiintoisia ja runsaita kantasolujen lähteitä, joilla on terapeuttisia sovellusmahdollisuuksia lääketieteen eri osa-alueilla kudosvaurioiden korjauksessa. Mesenkymaalisia kantasoluja esiintyy monissa eri kudoksissa, kuten esimerkiksi luuytimessä, rasvakudoksessa ja hampaan kudoksissa. Näillä kantasoluilla on kyky uusiutua kantasoluina ja erilaistua useiksi eri solutyypeiksi kudoksen signaalien ohjaamina. Toisin kuin luuytimen kantasolut, joiden esiintymistiheys luuytimessä on alhainen, rasvakudoksen kantasoluja saadaan eristettyä suurissa määrin joko rasvaimunäytteestä tai rasvakudosnäytteestä ja niitä voidaan vaivattomasti lisätä laboratoriossa. Myös hampaan kantasolupopulaatioita saadaan eristettyä runsaasti viisaudenhampaasta. Lisäksi viisaudenhampaat ovat ihmiselle useimmiten tarpeettomia, ja ne voidaan poistaa suhteellisen kivuttomasti. Rasvakudoksen ja hampaan kantasoluilla on samantyyppisiä ominaisuuksia kuin luuytimen kantasoluilla; ne erilaistuvat laboratorio-olosuhteissa vähintään luusolujen, rustosolujen ja rasvasolujen suuntaan. Lisäksi rasvakudoksen kantasolujen on todettu alentavan immunologista vastetta, estävän vakavaa käänteishyljintäreaktiota solu- ja eläinmalleissa, ja niiden on todettu olevan geneettisesti vakaampia pitkäaikaisviljelyssä kuin luuytimen kantasolujen.

Ennen kuin soluja voidaan hyödyntää kliinisissä kantasoluhoidoissa, niitä täytyy lisätä laboratoriossa. Tällä hetkellä yleisesti käytössä olevat soluviljelyreagenssit sisältävät eläinperäisiä ainesosia, joista turvallisuussyistä on päästävä eroon, sillä ne voivat kliinisessä käytössä aiheuttaa vakavan immuunivasteen soluterapiapotilaassa. Muihin eläinperäisten ainesosien tuomiin riskeihin kuuluu viruksien ja bakteerien aiheuttamat infektiot, prionit ja toistaiseksi tunnistamattomat eläintaudit.

Tässä työssä tutkittiin aikuisten eri kudoksista peräisin olevien kantasolujen uusiutumis- ja erilaistumiskykyä laboratorio-olosuhteissa. Tutkimuksissa käytettiin viisaudenhampaan kantasolupopulaatioita, kuten hammaspulpan, -follikkelin ja juurikalvon kantasoluja sekä rasvakudoksen kantasoluja. Lisäksi rasvakudoksen kantasolujen kasvatusolosuhteita kehitettiin vastaamaan Euroopan unionin edellyttämien hyvien tuotantotapojen (eng. Good Manufacturing Practice, GMP) vaatimuksia. Viimeisessä osatyössä arvioitiin rasvakudoksen kantasolujen kliinistä soveltuvuutta kokeellisessa kudosteknologisessa luunkudoksen rekonstruktiossa.

Tulokset osoittivat hampaan kantasolupopulaatioilla olevan mesenkymaalisille kantasoluille ominaisia piirteitä ja kyky erilaistua rusto- ja luusolujen suuntaan. Siten ne soveltuisivat käytettäviksi kovakudossovelluksissa kallon ja kasvojen alueella. Rasvakudoksen kantasolut ilmensivät eri kasvatusolosuhteissa mesenkymaalisille kantasoluille tyypillisiä pintamolekyylejä ja ne voitiin erilaistaa luu-, rusto- ja rasvasolujen suuntaan. Yhtäläisyyksistä huolimatta eri kasvatusolosuhteissa viljellyissä rasvakudoksen kantasoluissa esiintyi olennaisia eroja solusyklin etenemisen ja solujen erilaistumisen keskeisten geenien ilmentymisessä.

Rasvakudoksen kantasoluja hyödyntäviä kliinisiä soluterapiakokeita on paraikaa käynnissä, mikä edellyttää keskittymistä laboratorio-olosuhteissa lisättyjen solujen turvallisuuteen, menetelmien toistettavuuteen ja laatuun. Tämä työ osoittaa, että eri kudoksista lähtöisin olevilla kantasoluilla on samantapaiset ominaispiirteet, ja niitä voidaan hyödyntää kantasoluterapiassa. Tulokset osoittavat myös kasvatusolosuhteilla olevan huomattava vaikutus soluihin geenitasolla; muokkaamalla kasvatusolosuhteita voidaan vaikuttaa kliiniseen tarkoitukseen tähtäävän solutuotteen laatuun. Lisäksi solukasvatusolosuhteiden huolellinen arviointi erilaisilla, kuitenkin tarkoin määrätyillä analyysimenetelmillä on ensiarvoisen tärkeää, jotta solujen soveltuvuus voidaan määrittää. Täydentäviä prekliinisiä turvallisuus- ja tehokkuustutkimuksia tarvitaan vielä ennen kuin aikuisten kantasolujen kaikki hyödyntämismahdollisuudet voidaan toteuttaa.

Adipose and dental tissues are attractive and abundant sources of stem cells with therapeutic applicability in diverse medical fields for the repair and regeneration of acute and chronically damaged tissues. Mesenchymal stem cells (MSCs) are found in a variety of tissues including bone marrow, adipose tissue and dental tissues, and reside within the tissue in a hierarchical arrangement maintaining their proliferative potential and differentiation stage. Importantly, unlike the human bone marrow stromal/stem stem cells (BMSCs) that are present at low frequency in the bone marrow, adipose stem cells (ASCs) can be retrieved in high number from either liposuction aspirates or subcutaneous adipose tissue fragments and can easily be expanded in vitro. Also, the dental stem cell sources (DSCs) can easily be retrieved in high numbers from third molars representing an appealing source of MSCs owing to the fact that third molars are an expendable tissue that can be removed with minima! l surgical stress. ASCs and DSCs display properties similar to those observed in BMSCs and, upon induction, undergo at least osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation in vitro. Furthermore, ASCs have been shown to be immunoprivileged, prevent severe graft-versus-host disease in vitro and in vivo and to be more genetically stable in long-term culture than BMSCs. They have also proven applicability in other functions, such as providing hematopoietic support and gene transfer.

Nevertheless, expansion of ASCs and DSCs is necessary prior to performing clinical studies. Currently, standard in vitro cell expansion techniques utilize reagents of animal origin as part of the cultivation procedures. Due to critical safety issues, use of animal-derived reagents in clinical applications is not a suitable option, since severe immune response may develop in the recipient. Other possible risks for the recipient related to the introduction of animal-derived reagents include viral or bacterial infections, prions, and unidentified zoonoses.

In this study, the renewal and differentiation capacity of stem cells from different adult tissues were evaluated in vitro. Stem cells from impacted third molars such as dental pulp stem cells, dental follicle cells and periodontal ligament stem cells, and also stem cells from adipose tissue were investigated. Furthermore, for ASCs, the culture conditions were developed and optimized to meet the GMP (Good Manufacturing Practice) standards set by the European Union. In the final part of the study, the clinical applicability of adipose stem cells was evaluated in a bone tissue engineering case study.

The results show, that the cells from the dental pulp, follicle, and periodontal ligament exhibit mesenchymal stem cell-like characteristics and show capacities for chondrogenic and osteogenic differentiation thus suggesting usability in hard tissue engineering applications in the craniofacial area. Furthermore, albeit ASCs showed comparable surface marker expression profiles and multipotential differentiation capacity in different culture conditions demonstrating characteristics of mesenchymal stem cells, fundamental differences in genes central for cell cycle progression and cell differentiation were detected.

Clinical stem cell therapy studies using ASCs are under way, which call for a strong focus on the safety, reproducibility and quality of transplanted in vitro expanded stem cells. The results from the study suggests that cells from various adult tissue sources may be utilized for clinical cell therapy, but that the choice of culturing supplements has considerable effects on the cells at gene level. Thus, the culturing conditions may have significant implications on the cell product aimed for clinical therapy. The results show that proper characterization of culture conditions with different, yet specific, analyzing methods is necessary for cells intended for clinical stem cell therapy. Nevertheless, additional pre-clinical safety and efficacy studies will be needed before the promise of the adult stem cells can be fully realized.