Optimizing detection of IgA in patients with dermatitis herpetiformis

Abstract

Dermatitis herpetiformis (DH) is an autoimmune disease that manifests as a blistering rash, primarily on the elbows, knees, and buttocks. It is often considered to be an extraintestinal manifestation of celiac disease (CeD), since the diseases share genetic predisposition through the human leukocyte antigen (HLA)-DQ2 or -DQ8 haplotypes, and both diseases are driven by the ingestion of gluten, a protein found in grains such as wheat, rye and barley. In both DH and CeD, gluten causes an autoimmune reaction, which leads to the production of immunoglobulin A (IgA) class antibodies against transglutaminases. In CeD, the antibodies target tissue transglutaminase (TG2). In DH, the main autoantigen is epidermal transglutaminase (TG3), mostly found in the skin. Both anti-TG3 and anti-TG2 antibodies can be found in DH patients’ serum. Although not the main autoantigen, anti-TG3 antibodies has been found in some CeD patients, indicating that they are not targeted exclusively in DH. In the skin of DH patients, granular deposits of IgA form in the papillary dermis, which can be observed using direct immunofluorescence, a standard method for diagnosing DH. However, the immunopathogenic pathway and mechanism remain relatively unknown, especially what causes the blisters to form and why they start forming in some people but not in others, highlighting the need for more research of DH.

The aim of this study was to optimize a protocol to detect IgA in skin samples from patients with DH using Western blot (WB). The process focused on five protein extraction methods used on ten different skin samples from DH patients, to find which method would produce an optimal protein yield. IgA detection was performed using WB. For the protocol, different buffers for blocking and antibody binding were tested, as well as a comparison of two different antibody concentrations.

The protocol was successfully produced, and it was found that combining the extraction methods extraction produced the optimal results. It was also found that a 5% skimmed milk in 1x TBS+Tween20 (TBST) produced the clearest results with the least background signalling. The two antibody concentrations showed little difference between them. Although WB is a commonly used method, it has not been used for characterizing IgA in DH. This study showed that detecting IgA in DH skin samples is possible and provides clear and reproducible results, highlighting the potential of WB as an additional tool to further study IgA in DH.

Ihokeliakia (Dermatitis herpetiformis, DH) on autoimmuunisairaus, jonka ensisijainen oire on rakkuloiva ihottuma, jota esiintyy erityisesti kyynärpäissä, polvissa ja pakaroissa. Ihokeliakiaa kuvaillaan usein suoliston ulkopuolella esiintyvänä keliakian (CeD) muotona niiden samankaltaisuuksien vuoksi. Molemmat sairaudet voivat kehittyä yksilöille, joilla on ihmisen leukosyyttiantigeeni (HLA) -DQ2- tai -DQ8-haplotyyppi. Sekä ihokeliakiassa että keliakiassa autoimmuunireaktiota ajaa gluteeni, eli proteiini, jota esiintyy viljoissa, kuten vehnässä, rukiissa ja ohrassa. Reaktio johtaa immunoglobuliini A (IgA) -luokan vasta-aineiden tuotantoon transglutaminaasi-entsyymejä vastaan. Keliakiassa vasta-aineet kohdistuvat suoliston kudostransglutaminaasiin (TG2), kun taas ihokeliakiassa vasta-aineet kohdistuvat iholla löydettävään epidermaaliseen transglutaminaasiin (TG3), jota pidetään reaktion pääasiallisena autoantigeenina. Sekä anti-TG3- että anti-TG2-vasta-aineita voidaan havaita ihokeliakiapotilaiden seeruminäytteistä. Vaikka TG3 ei ole keliakian pääasiallinen autoantigeeni, anti-TG3-vasta-aineita on havaittu myös keliakiapotilaiden seeruminäytteissä, viitaten siihen, että TG3-vasta-aineet eivät ole yksinomaan ihokeliakialle ominaisia.

Ihokeliakiassa IgA alkaa kertyä papillaariseen dermikseen muodostaen rakeisia kertymiä. Näitä kertymiä voidaan tutkia suoran immunofluoresenssin avulla, jota käytetään myös ihokeliakian diagnosointiin. Ihokeliakian patofysiologia on kuitenkin osittain tuntematon, erityisesti mikä aiheuttaa rakkuloiden muodostumisen ja miksi niitä kehittyy joillekin ihmisille, mutta ei toisille.

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli luoda työohje IgA-vasta-aineen havaitsemiseen ihokeliakiapotilaiden ihonäytteistä. Työjakson aikana kokeiltiin viittä eri proteiinin eristysmenetelmää, joita sovellettiin kymmeneen eri ihonäytteeseen, jotta löydettäisiin menetelmä, joka tuottaisi parhaan proteiinisaannon. IgA:n havaitseminen toteutettiin Western blot-menetelmällä (WB). Eri puskuriliuoksia kokeiltiin, löytääkseen sopiva puskuri vasta-aineiden sitoutumiselle, joka tuottaisi myös vähiten taustasignaalia. Puskureiden lisäksi kahta eri vasta-ainepitoisuutta kokeiltiin.

Työohje saatiin onnistuneesti luotua, ja havaittiin, että yhdistelmä eri proteiinin eristysmenetelmistä tuotti parhaat tulokset ihonäytteissä. Sen lisäksi, 5 % rasvaton maito 1x TBS+Tween20-liuoksessa (TBST) tuotti selkeimmät tulokset WB-menetelmässä. Kahden vasta-ainepitoisuuden välillä ei havaittu suurta eroa tuloksissa. Vaikka WB on yleisesti käytetty menetelmä, sitä ei ole aiemmin hyödynnetty IgA:n havaitsemiseen ihokeliakiapotilailla. Tämä tutkimus osoitti, että IgA:n havaitseminen ihonäytteistä on mahdollista, ja se tuottaa selkeitä sekä toistettavia tuloksia, mikä vahvistaa WB-menetelmän potentiaalin IgA:n tutkimiseen ihokeliakiassa.