Ischemic Stroke In vitro : Towards Multi-Dimensional Human Stem Cell-based Neuronal Models

Abstract

Yksi yleisimpiä keskushermostoon liittyviä kuolinsyitä on iskeeminen eli verenkierron häiriintymisestä johtuva aivohalvaus. Taustalla oleva verisuonen tukos aiheuttaa hapen ja ravinteiden puutteen, johtaen hermosolujen vaurioitumiseen ja mahdollisesti kuolemaan. Huolimatta intensiivisestä tutkimuksesta, aivohalvaukseen ei ole löydetty hermosoluja suojaavia tai korjaavia hoitomuotoja.

Tällä hetkellä suurin osa aivovaurioiden tutkimuksesta tehdään <i>in vivo</i> eläinkokeilla, mutta ne ovat kalliita, eettisesti raskaita, aikaa vieviä ja mikä merkittävintä, eläinsolujen ja -aivojen toiminta on monella tapaa erilaista kuin ihmisellä. Yli 90% ihmisillä tehtävistä kliinisistä kokeista epäonnistuu, mikä kertoo nykyisten prekliinisten <i>in vivo</i> -kokeiden puutteista. Tulevaisuudessa nämä eläinkokeet voitaisiin osittain korvata tai täydentää <i>in vitro</i> -tehtävillä laboratoriotutkimuksilla, joissa käytettäisiin ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettuja soluja fysiologisesti aivohalvausta muistuttavissa kasvatusympäristöissä. Tämän väitöskirjan päätavoitteena oli kehittää <i>in vitro</i> -malli iskeemisen aivohalvauksen mallinnukseen. Käytin yhteensä neljää eri ihmisperäistä kantasolulinjaa ja kahta hermosoluerilaistamismenetelmää, ja tuotin näillä riittävän kypsiä hermosoluja <i>in vitro</i>-mallinnukseen. Vertailin yhteensä kahdeksaa eri hydrogeelimateriaalia niiden mekaanisten ja biologisten hermosolujen kasvua tukevien ominaisuuksien sekä geelien käytettävyyden mukaan. Kaikki ominaisuudet huomioon ottaen kollageeni osoittautui parhaaksi materiaaliksi kolmiulotteiseen (3D) kasvatukseen. Vähähappiset olosuhteet optimoitiin kaksiulotteiseen (2D) hermosoluviljelmään ja vähäglukoosiset sekä -happiset olosuhteet optimoitiin 3D viljelmään. Lisäksi kehitin tarkempia kuva-analyysimenetelmiä 3D aivohalvausmallin tutkimiseen ja mittaamiseen konfokaalikuvantamisen avulla sekä optimoin mikroelektrodihila-mittausta toiminnallisen hermosoluvasteen analysoimiseen 2D aivohalvausmallissa. Näytän, kuinka hermosoluverkostojen muoto muuttuu huomattavasti 3D aivohalvausmallissa: hermosolujen haarakkeiden pituus lyhenee, kokonaistilavuus pienenee ja yhteydet toisiin hermosoluihin vähenevät. Sen sijaan 2D aivohalvausmallissa hermosoluverkostojen muoto ei muutu näin huomattavasti, mutta toiminnallisuus laskee lähelle nollaa hapenpuutteen seurauksena. Aktiivisuus kuitenkin palautuu spontaanisti 72 tunnin reperfuusion eli hapen ja ravinteiden palauttamisen jälkeen.

Lopuksi testasin yhtenä potentiaalisena hoitomenetelmänä aivohalvaukseen verihiutaleiden erittämiä solunulkoisia vesikkeleitä. Ihmisperäisten ja kliinisesti relevanttien verestä eroteltujen vesikkelien käyttö on herättänyt runsaasti mielenkiintoa varsinkin niiden veriaivoesteen läpäisykyvyn takia. Tarvitsemme kuitenkin lisää perustutkimusta ja <i>in vitro</i> -mallien hyödyntämistä, jotta ymmärtäisimme paremmin vesikkelien toimintaa vaurioiden mahdollisessa korjaamisessa. Näytin, että vesikkelit päätyvät hermosolujen sisälle, samoihin sijainteihin soluelinten kanssa. Tutkimuksessani vesikkelit eivät vaikuttaneet hermosoluihin välittömästi hypoksian jälkeen, mutta kahden viikon seurannassa ne lisäsivät hermosolujen aktiivisuutta. Tämä korostaa aivohalvausmallien neljännen ulottuvuuden eli riittävän seuranta-ajan tärkeyttä.

Edelleen kehitettynä tämän aivohalvausmallin avulla voitaisiin vähentää eläinkokeiden käyttöä tutkimuksessa ja lääketeollisuudessa. Koska laboratoriossa emme kuitenkaan pääse samaan systeemiseen monimutkaisuuteen kuin elävässä ihmisessä, todennäköisesti paras keino on yhdistellä erilaisia solumalleja ja tehdä johtopäätöksiä niiden antamista tuloksista. Vaikka 3D kasvatusympäristö mahdollistaa paremmin <i>in vivo</i> -olosuhteet soluille, on joissakin tutkimuskysymyksissä parempi pitäytyä toistaiseksi yksinkertaisemmassa 2D kasvatuksessa. Tulevia tutkimuksia suunnitellessa tulee ottaa nämä asiat huomioon, jotta on mahdollista tehdä realistisia johtopäätöksiä ja kehittää toimivia hoitoja aivohalvaukseen.

Stroke is one of the leading causes of death and long-term disability worldwide, yet the translation of preclinical findings into effective clinical therapies has been limited. One major challenge is the lack of physiologically and clinically relevant <i>in vitro</i> models built with human cells to help preclinical translation. This thesis aims to advance the development of models by integrating human-derived cells, biomimetic environments, and pathologically relevant stimuli to better simulate ischemic stroke conditions <i>in vitro</i>.

The work presented here focuses on establishing a robust <i>in vitro</i> stroke model using human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neural cells, including mainly cortical neurons, and lesser amounts astrocytes, cultured under conditions that mimic the penumbra area after stroke. Both hypoxia and oxygen-glucose deprivation (OGD) protocols were optimized to induce ischemic-like injury in two-(2D) and three-dimensional (3D) neuronal cultures. Subsequent cellular responses were characterized through morphological and functional analyses. This required optimization of image analysis protocols capable of capturing and quantifying the complex 3D neuronal network morphologies and changes after OGD insult. Furthermore, functional changes in 2D neuronal networks subjected to hypoxia were studied.

Four different human cell lines and 2 neuronal differentiation protocols were used to produce mature enough neurons for <i>in vitro</i> models. In total, 8 different hydrogels were screened for 3D neuronal culture, and their properties in terms of mechanical and biological supportiveness for neuronal growth as well as usability and stability of gelation procedure were compared. Taken together, the collagen type I-based hydrogel performed best. Morphological changes in 3D stroke model were evident: neurite length, volume, and connectedness were decreased after 24 h OGD followed by 24 h reperfusion. In contrast, in 2D stroke model, the morphological changes were not as dramatic, but neuronal activity dropped near zero after 24 h hypoxia. Nevertheless, neurons were capable of spontaneous recovery after 72 h reperfusion period.

Finally, clinically potential treatment for stroke was tested in 2D model. Extracellular vesicles (EVs) can cross the blood-brain barrier and their use in stroke research has raised high interest. Here, human platelet-derived EVs were added to neuronal cultures, and their internalization and colocalization with cellular organelles were confirmed with advanced imaging analysis. EVs did not affect neuronal activity acutely after hypoxia, but when followed for 2 weeks, the activity increased. This highlights the importance of fourth dimension (4D) in <i>in vitro</i> stroke modeling: sufficient follow-up period.

By comparing <i>in vitro</i> models to <i>in vivo</i> animal models, this thesis evaluates the translational relevance of these models and their potential applications. Special emphasis was placed on comparing the use of 2D and 3D neuronal cultures in these <i>in vitro</i> models. The results underscore the importance of human-based, multicellular systems in bridging the translational gap and provide a foundation for reliable stroke models that are both ethically sustainable and clinically meaningful.