Development of DNA-Based Bioassays for Cancer Detection

Abstract

Tässä väitöskirjassa tavoitteena oli kehittää testi, joka perustuu syöpäsoluista vapautuneen soluvapaan DNA:n havaitsemiseen munasarjasyöpäpotilailla. Toisena tavoitteena oli kehittää virtsatesti, joka perustuu syöpäsolujen DNA:n analysointiin uroteelisyövän havaitsemiseksi. Lisäksi tutkimme genomisia muutoksia uroteelisyöpäpotilaita, joilla on Lynchin syndrooma. Tämä väitöstyö hyödyntää laskennallisia menetelmiä, joilla tutkitaan DNA-sekvensointidataa. Tässä työssä käytetty aineisto on peräisin nestebiopsioista, joita on otettu potilailta hoidon eri vaiheissa. Lisäksi sekvensointidataa on saatu syöpäkudoksista, jotka on saatu pääsääntöisesti leikkausoperaatioista.

Munasarjasyövässä potilaat tarvitsevat hoitojen jälkeistä seurantaa taudin mahdollisen uusiutumisen tai etenemisen havaitsemiseksi. Munasarjasyöpä diagnosoidaan usein myöhäisessä vaiheessa ja syöpä uusiutuu usein hoitojen jälkeen. Näiden tekijöiden vuoksi munasarjasyöpä on yksi yleisimmistä syöpäkuolemiin johtavista taudeista.

Munasarjasyöpäpotilailla hyödynnettiin menetelmää, jossa entuudestaan tunnettuja syöpägenomin muutoksia pyrittiin havaitsemaan potilaan seuranta-ajan verinäytteistä. Yhden tai useamman mutaation havaitseminen seuranta-ajan näytteestä viittaa jäännöstautiin. Tätä menetelmää hyödyntämällä kaikki aineistossa olevien potilaiden taudin etenemiset tunnistettiin ja 12:ssa verinäytteessä jäännöstauti havaittiin ennen tavanomaista seurantaa.

Tutkimuksessa kehitimme 25:een geeniin perustuvan virtsatestin, joka hyödyntää genomisten muutosten havaitsemista DNA:sta, joka on eristetty virtsassa mahdollisesti olevista syöpäsoluista. Virtsatestiä käytettiin uroteelisyövän havaitsemiseksi syövän diagnostisessa ja seurantavaiheessa. Tulokset osoittivat, että 100 ml virtsanäytettä voitaisiin käyttää virtsarakon tähystyksen korvaajana. Testin sensitiivisyys oli 95% diagnostisessa vaiheessa ja 90% seurantavaiheessa. Aineistossa oli yhteensä 122 uroteelisyöpäpotilasta, joiden diagnostisessa virtsanäytteessä oli vähintään 5% syöpäosuus ja syövän tiedettiin kehittyneen sporadisesti. Lisäksi kolmen potilaan virtsanäytteessä havaittiin ituradan patogeeninen variantti, joka vaikuttaa geeneihin, jotka osallistuvat DNA:n kahdentumisvirheiden korjaamiseen. Näiden geenien ituradan patogeeniset variantit aiheuttavat Lynchin syndrooman. Alustavat tutkimustulokset osoittivat, että näillä kolmella potilaalla oli poikkeuksellinen geenimutaatioiden kirjo, joka poikkesi sporadisesti kehittyneistä uroteelisyövistä.

Laajemmalla potilaskohortilla selvitimme yleisiä geenimutaatioita, joita havaitsimme Lynchin syndrooman kautta kehittyneissä uroteelisyövissä. Materiaalina käytettiin biopankkien tallettamia kudosnäytteitä. Tutkimuksessa selvisi, että Lynchin syndrooman liitettävistä uroteelisyövistä puuttui yleisimmät muutoin havaittavat geenimutaatiot, kuten TERT-promoottorialueen mutaatiot. Näiden sijasta syöpägenomit olivat mutatoituneet oireyhtymälle tunnetuilla mutaatiomekanismeilla.

Tässä väitöskirjatyössä esitetyt tutkimukset sisältävät bioinformatiikan menetelmiä, joilla on analysoitu potilaiden sekvensointidataa. Työn tarkoituksena on parantaa syöpäpotilaiden hoitoa havaitsemalla ajoissa tai poissulkemalla riski mahdollisesti pahanlaatuisesta kasvaimesta. Lisäksi DNA-sekvensointidata sisältää informaatiota, jolla voidaan tutkia patogeneesiä geenimutaatioiden kautta. Tämä työ osana tulevaa tutkimustyötä tähtää edistämään syöpäepäilyksen tai syöpätaudin kanssa elävien henkilöiden hoitoa ja laskemaan syöpään liittyvien kustannuksien vaikutusta yksilölle ja terveydenhuoltojärjestelmälle.

Uroteelisyöpä on kymmenenneksi yleisin syöpä maailmanlaajuisesti aiheuttaen yli 200 000 kuolemaa vuosittain. Vaikka uroteelisyöpään viittaavat oireet johtuvat useimmiten muista kuin syöpäperäisistä syistä, ne edellyttävät diagnostisia tutkimuksia. Uroteelisyöpädiagnoosin saaneet potilaat tarvitsevat syöpähoitoja, jotka valitaan tarkemman diagnoosin perusteella. Hoitojen jälkeinen seuranta on myös tarpeen.

In this doctoral work, the aim was to implement a circulating tumor DNA assay to detect tumor cells in ovarian cancer patients, use a urine tumor DNA assay to detect urothelial cancer in patients at risk for the disease or its recurrence, and to investigate the genomic landscape of Lynch syndrome patients diagnosed with urothelial cancer. Computational methods were used to investigate the cancer tumor’s DNA alterations. The data used in this thesis originated from liquid biopsies taken at different timepoints during patient management and from tumor tissue mainly collected during surgical operations.

Ovarian cancer patients undergo post-treatment surveillance to detect recurrences and progressions. Ovarian cancer is often detected at an advanced stage, with post-treatment recurrences occurring frequently. Due to late detection and the high rate of recurrence, ovarian cancer is one of the leading causes of cancer deaths globally.

A tumor-informed approach was used with the ovarian cancer patients, where a tumor biopsy was analyzed to gain an understanding of each patient's genomic alterations. This information was used to analyze patient plasma samples. One or more mutations rediscovered in a post-operative sample indicate the presence of residual disease. Using this method, all progressions were identified in the cohort, and 12 plasma samples were positive for residual disease before standard surveillance indicated progression.

Urothelial cancer is the tenth most common cancer globally, resulting in over 200,000 deaths yearly. Patients presenting with urothelial cancer symptoms require diagnostic procedures, even though the symptoms are often non-malignant in origin. Patients diagnosed with urothelial cancer require treatment based on the specific subtype of the disease, and a rigorous post-treatment surveillance period is also required.

A 25-gene urine tumor DNA-based assay was designed to accurately predict if patients with urothelial cancer were cancer-positive or -negative. The same approach was also used in the surveillance setting. The results indicated that a 100 ml urine sample could be used as a cystoscopy replacement, as the test had an overall 95% sensitivity in the diagnostic setting and a 90% sensitivity in the surveillance setting when a diagnostic urine sample-informed approach was used. The cohort included 122 urothelial cancer patients that had a sporadic genomic landscape and a ≥5% cancer cell fraction in their diagnostic urine sample that could be used to assess the mutations harbored in the cancer genome. Also, three patients had a germline pathogenic variant affecting one of their DNA mismatch repair genes, indicative of Lynch syndrome. The preliminary finding was that these three patients had an abnormal genomic landscape compared to the sporadic patients.

To further investigate the genes that are mutated in Lynch syndrome-associated urothelial cancer, we sequenced tissue samples stored in biobanks. We discovered that these patients were missing the most common genomic alteration, the TERT promoter mutation, and instead had a high number of different mutations commonly found in the tumors of Lynch syndrome patients.

The work presented in this dissertation comprises the use of bioinformatic approaches to analyze patient sequencing data, with the aim of improving the treatment of cancer patients by accurately detecting the presence or absence of malignant tumors. In addition, the DNA sequencing data enables the study of genetic mutations driving pathogenesis. This work, in combination with future studies, aims to improve the lives of patients with or at risk of cancer while also decreasing the costs of patient management for individuals and healthcare systems.