Hydrogel-based Platforms for Epithelial Mechanobiology : From force transmission to retinal renewal

Abstract

Solut sijaitsevat fysikaalisesti ja biokemiallisesti monimutkaisessa ympäristössä, jossa ne aistivat ja reagoivat sekä mekaanisiin että biokemiallisiin signaaleihin. Lisäksi solut ovat vuorovaikutuksessa keskenään joko pidemmän välimatkan yli tai suoraan solu-solu-liitosten välityksellä. Tämä kudosten monimutkaisuus ei kuitenkaan toteudu yksinkertaistetuissa soluviljelyolosuhteissa, mikä heikentää näiden <i>in vitro</i>-mallien fysiologista merkityksellisyyttä ja rajoittaa ymmärrystämme siitä, kuinka solut mukautuvat ja kommunikoivat ympäristönsä kanssa. Tämän eron kaventamiseksi on kehitetty edistyneitä solukasvatusmalleja, jotka jäljittelevät paremmin <i>in vivo</i>-olosuhteita. Hydrogeelit ovat materiaaleja, joiden mekaanisia ja biokemiallisia ominaisuuksia voidaan muokata vastaamaan erilaisia soluympäristöjä. Näiden yhdistäminen monisoluisiin epiteelimalleihin mahdollistaa kontrolloidut ja fysiologisesti relevantit mekanobiologiset tutkimukset.

Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia, kuinka solujen ympäristön fysikaaliset ominaisuudet vaikuttavat solujen voimantuottoon sekä voiman välittymiseen ja etenemiseen epiteelissä. Tätä varten kehitettiin hydrogeelipohjaisia soluviljelymalleja, jotka mahdollistivat mekanobiologiset tutkimukset aiempaa enemmän <i>in vivo</i>-kaltaisissa tutkimusolosuhteissa. Yksikerrosepiteelejä kasvatettiin sekä laajasti käytetyillä synteettisillä polyakryyliamidi (PA) geeleillä että hiljattain kehitetyillä spidroiiniproteiinipohjaisilla geeleillä. Soluja viljeltiin näillä hydrogeeleillä joko kaksiulotteisesti (eng. two-dimensional, 2D), jolloin solut kasvoivat levymäisen hydrogeelin pinnalla, tai kolmiulotteisesti (eng. three-dimensional, 3D), jolloin solut kasvoivat hydrogeelin sisällä. Yleisesti käytettyjen MDCK-epiteelisolujen lisäksi tässä työssä hyödynnettiin erikoistuneita verkkokalvon pigmenttiepiteelin (eng. retinal pigment epithelium, RPE) soluja. Silmässä RPE muodostaa rakenteellisen ja toiminnallisen rajapinnan neuraalisen verkkokalvon kanssa sekä osallistuu valoa aistivien pigmenttien kierrätykseen. RPE myös ylläpitää verkkokalvon elinvoimaisuutta ja mahdollistaa valoherkkien näköaistinsolujen uusiutumisen. Tämä RPE:n ja verkkokalvon rajapinta puuttuu nykyisistä soluviljelymenetelmistä, ja tässä työssä sitä mallinnettiin PA-geeleillä yhdessä kantasoluista erilaistettujen RPE-solujen kanssa.

Tulokset osoittavat, että verkkokalvoa mekaanisesti mallintava hydrogeeli tarjosi soluviljely-ympäristön, joka vastasi aiempaa paremmin RPE:n luonnollisia olosuhteita ja mahdollisti RPE-solujen kiinnittymisen niiden apikaalipuolella sijaitsevaan hydrogeeliin. Kiinnittyminen tapahtui solujen aktiinitukirangan välityksellä ja hydrogeeli ei haitannut solujen ominaispiirteitä tai toiminnallisuutta. Mallin avulla kartoitettiin myös RPE-solujen tuottamia aktiinivälitteisiä voimia näköaistinsolujen uusiutumisen aikana, ja niiden voimakkuus oli verrattavissa muihin solutyyppeihin. Lisäksi osoitettiin materiaalin jäykkyyden vaikutus solujen voimantuottoon ja voiman välittymiseen yksikerroksisissa MDCK-epiteeleissä. Pehmeä hydrogeeli, joka on myös helpommin muuntuva, mahdollisti suuremman epiteelin siirtymän verrattuna jäykempään ympäristöön, ja solujen voimantuotto oli pehmeällä alustalla heikompaa. Koska PA-geelit soveltuvat vain 2D-viljelyyn, tässä työssä hyödynnettiin myös spidroiiniproteiinipohjaisia, mekaanisesti muokattavia hydrogeelejä, jotka sisälsivät bioaktiivisia komponentteja mahdollistaen solujen kiinnittymisen. Nämä geelit mahdollistivat sekä 2D-viljelyn PA-geelien tapaan että 3D-viljelyn, jossa MDCK-solut muodostivat pallomaisia, keskeltä onttoja rakenteita, mikä vastaa epiteelin järjestäytymistä <i>in vivo</i>-olosuhteissa.

Yhteenvetona tulokset osoittavat, että yksikerrosepiteeleillä on aktiivinen rooli voiman tuotossa ja sen välittymisessä. Lisäksi työ korostaa hydrogeelien tarjoamia mahdollisuuksia muokattavina materiaaleina, joita voidaan hyödyntää mekanobiologisissa tutkimuksissa ja <i>in vivo</i>-kaltaisten soluviljelymallien kehittämisessä. RPE:n kiinnittyminen verkkokalvoa mallintavaan hydrogeeliin sekä solujen voimantuotto tukevat näkemystä siitä, että RPE on mekaanisesti aktiivinen yhteistyössään verkkokalvon kanssa. Työ alleviivaa yksikerrosepiteelien mekaanista dynaamisuutta ja tarjoaa monipuolisia <i>in vitro</i>-malleja mekanobiologiseen tutkimukseen.

Cells reside in physically and biochemically complex environments, where they sense and respond to mechanical cues and biochemical signals, and interact with each other either over distance or through direct cell-cell contacts. However, the complexity of native tissues is not fully recapitulated in simplified cell culture conditions. This limits the physiological relevance of <i>in vitro</i> systems and hinders our understanding of how cells interact with and adapt to their surroundings. To bridge this gap between in vivo and <i>in vitro</i> environments, advanced model systems have been developed, including hydrogel-based platforms that offer tunable mechanical and biochemical properties. When combined with multicellular systems such as epithelial monolayers, these models allow well-controlled and physiologically relevant mechanobiological studies.

The aim of this thesis was to investigate how the physical properties of the extracellular environment influence force generation, transmission, and propagation in epithelial monolayers. To achieve this, hydrogel-based platforms were developed to enable mechanobiological studies while providing more in vivo-like experimental conditions. Epithelial monolayers were cultured on widely used synthetic polyacrylamide (PA) gels or on more recently developed spidroin protein-based gels. These model systems were used either in two-dimensional (2D) configurations, where cells were cultured on sheet-like hydrogels, or in three-dimensional (3D) cultures, with cells embedded within the gels. In addition to commonly used MDCK epithelial cells, specialized retinal pigment epithelium (RPE) cells were utilized. In the eye, the RPE is structurally and functionally connected to the neural retina, participates in the visual cycle, maintains retinal viability, and enables the daily renewal of the vision-initiating photoreceptor cells. To mimic this RPE-retina interface, which is absent in conventional RPE culture systems, soft PA gels were incorporated into stem cell-derived RPE cultures.

As a result, the retina-mimicking hydrogels provided more <i>in vivo</i>-like culture conditions, enabling RPE cells to adhere to the apically placed gel through actinmediated adhesions without compromising key characteristics of the RPE. This platform enabled characterization of the substantial, actin-driven forces exerted locally by RPE cells on their apical side during photoreceptor renewal, comparable in magnitude to those observed in other adherent cell types. Furthermore, the results demonstrate that substrate stiffness and composition influence force generation and transmission in MDCK monolayers, with soft, deformable substrates allowing greater monolayer displacement while reducing traction force generation compared to stiffer environments. While PA gels are limited to 2D cultures, spidroin-based gels provide platforms with tunable mechanical properties and bioactive motifs, enabling both 2D and 3D cultures. In 2D, spidroin gels supported MDCK monolayer formation similarly to standard PA gels, whereas in 3D, embedded MDCK cells organized into spheroidal structures with central lumens, resembling the organization of epithelial tissues <i>in vivo</i>.

In conclusion, these findings underscore the active role of epithelial monolayers in force generation and transmission, while demonstrating that hydrogels are tunable mechanical platforms that enable mechanobiological studies and provide more <i>in vivo</i>-like platforms for cell culture. Moreover, the adhesion and force transmission from RPE cells to the apically placed, retina-mimicking hydrogel reinforces the emerging view of the RPE as a mechanically active partner of the retina. Collectively, this work highlights the mechanically dynamic nature of epithelial monolayers and introduces versatile <i>in vitro</i> platforms for mechanobiological studies.