Mechanosensing at the Cell-ECM Interface in Epithelial Cells

Abstract

Erilaisten mekaanisten signaalien aistiminen on solujen, kudosten ja eliöiden hyvinvoinnin kannalta oleellista. Monet näiden mekaanisten signaalien aistimiseen vaadittavat rakenteet ja niiden perusmekanismit tunnetaan. Näihin lukeutuvat etenkin proteiinikompleksit, jotka liittävät vierekkäisten solujen solutukirangat toisiinsa, ja joilla solut tarttuvat soluväliaineeseen. Nämä liitoskohdat toimivat myös voiman välittäjinä sekä solun sisäisen signaloinnin keskuksina. Lisäksi mekanosensitiiviset ionikanavat voivat muuttaa solunsisäisiä ionipitoisuuksia. Epiteeli-, tuki- ja lihaskudoksissa kalsiumionit ovat erityisen merkittävässä asemassa, sillä ne säätelevät lukemattomien proteiinien ja signalointireittien toimintaa.

Vaikka monet mekanosensitiiviset rakenteet ja niiden perustoimintamekanismit tunnetaan, toistaiseksi ei täysin ymmärretä, miten solut pystyvät niiden avulla erottamaan lukemattomat erilaiset mekaaniset signaalit (kuten venytyksen, puristuksen, leikkausvoimat) toisistaan ja täten käynnistämään erilaiset, kunkin signaalin vaatimat vasteet. Kehossa solut myös altistuvat useille mekaanisille signaaleille samanaikaisesti, jolloin solujen on kyettävä aistimaan ja käsittelemään useita signaaleja yhtä aikaa, jotta oikea vaste voidaan käynnistää. Tätä ilmiötä ei kuitenkaan ymmärretä, sillä laboratorio-olosuhteissa mekaanista aistimusta on toistaiseksi tutkittu hyvin yksinkertaistetuissa olosuhteissa.

Tämän väitöskirjan tavoite oli selvittää, miten solut aistivat erilaisia mekaanisia signaaleja solu- ja kudostasolla, keskittyen solun ja sen kasvualustan väliseen vuorovaikutukseen epiteelisoluissa. Tätä varten kehitettiin kolme menetelmää, joilla soluihin voitiin kohdistaa pakkautumista, leikkausvoimia ja kasvatuspinnan sivuttaisliikettä. Kolmannessa menetelmässä sivuttaisliikkeen lisäksi voitiin säädellä kasvatuspinnan jäykkyyttä ja viskoosisuutta, jolloin pystyimme tutkimaan liikkeen ja pinnan ominaisuuksien yhteisvaikutusta. Mekaanisten ärsykkeiden aikana solujen vasteita voitiin kuvata reaaliajassa mikroskoopilla. Kalsiumkuvantamisella pystyttiin havaitsemaan yksittäisten solujen nopeita, sekunneissa syntyviä vasteita, kun taas solun muodonmuutosten avulla voitiin seurata minuuttien ja tuntien aikana käynnistyviä populaatiotason vasteita. Erilaisten lääkeyhdisteiden ja geenimuuntelun avulla pyrimme selvittämään, mitkä proteiinit ja mekanismit olivat avainasemassa kunkin mekaanisen ärsykkeen aistimisessa.

Tutkimuksemme perusteella epiteelisolukossa yksittäisillä soluilla on erityisiä tehtäviä, joiden ansiosta kudos pystyy sopeutumaan pakkautumiseen ilman vahingollista kuormitusta. Tämä tukee kasvavaa käsitystä siitä, että epiteelisolukko ei koostukaan identtisistä soluista. Lisäksi tuloksemme viittaavat siihen, että mekaaninen signaali voi aktivoida useita aistimusmekanismeja ja että pienetkin erot signaalissa voivat vaikuttaa siihen, missä suhteessa nämä eri mekanismit käynnistyvät. Osoitimme myös, että mekaanisen signaalin tyypin ja voimakkuuden lisäksi myös signaalin nopeudella on merkitystä solun aistimuksen kannalta. Tietokonemallinnuksen avulla havaitsimme, että solun kasvatuspinnan jäykkyys ja viskoosisuus vaikuttavat suoraan soluihin kohdistuvien voimien nopeuteen, ja sitä kautta mekaaniseen aistimukseen.

Johtopäätöksenä, tässä väitöskirjassa kehitettiin kolme uutta menetelmää, joilla voidaan luoda soluille mekaanisia ärsykkeitä ja seurata solujen vasteita reaaliajassa. Menetelmien avulla lisäsimme ymmärrystä siitä, miten solut aistivat mekaanisia signaaleja alapinnallaan, miten ympäristön mekaaniset ominaisuuden vaikuttavat solujen kykyyn aistia mekaanisia viestejä ja miten solukon heterogeenisyys vaikuttaa solujen kykyyn sopeutua ympäristönsä laajoihin mekaanisiin muutoksiin.

Cells exist in a physical world, whereby sensing different mechanical cues, and responding to them appropriately is crucial for the well-being of cells, tissues and the entire organism. Many of the structures and mechanisms that enable mechanosensing have been characterized. They include the different multiprotein adhesions that link together the cytoskeleton of two adjacent cells, or the cell to its underlying extracellular matrix, and act as force transmitters and signaling hubs. In addition, mechanosensitive ion channels can alter the ion concentrations within the cell in response to mechanical stimuli. In non-neuronal cells, fluctuations of Ca2+ ions are especially important as they control the function of a myriad of proteins and signaling pathways.

While the main mechanosensitive structures are known, it remains unclear how cells selectively activate these different structures and mechanisms to enable distinct responses to the vast range of mechanical cues. Moreover, <i>in vivo</i> cells are exposed to multiple mechanical cues simultaneously, which requires cells to integrate these different signals. Yet <i>in vitro</i>, mechanosensation mechanisms are often studied in highly isolated conditions.

The aim of this thesis was to understand how cells sense different types of mechanical stimuli on a cellular and population level, focusing on the interactions between cells and their underlying substrate in epithelial monolayers. To this end, three methods that generate different types of mechanical stimuli were developed. The methods generated population wide crowding, local shear, and substrate deformation. In the last method, the stiffness and viscosity of the substrate could also be controlled. This enabled studying how the mechanical properties of the substrate affect mechanosensing of dynamic cues. The methods allowed live-cell imaging to detect how cells responded to mechanical stimulation in real time. Calcium imaging was used to detect the initial mechanosensing responses (triggered on the time scale of seconds) in individual cells, whereas slower, population-wide responses (occurring within minutes to hours) were tracked by determining changes in cell morphology. To probe which mechanosensing mechanisms were used in response to the different types of stimuli, we targeted proteins of interest by pharmaceutical compounds and gene editing.

The results suggested that epithelial monolayers are not homogenous structures, but instead, cells have distinct roles that enable the tissue to sense mechanical stimuli without being damaged. This supports the known heterogeneity of epithelial monolayers and adds new insight into this phenomenon. The results also showed that even small differences in the mechanical stimulation can alter which mechanosensing mechanisms are activated. Mechanical stimulation most likely always activates several mechanisms, but the ratio at which the different mechanisms are activated seems to be fine-tuned depending on the stimulation. Moreover, our results showed that, in addition to the type of mechanical cue and its magnitude, also the dynamics of the cue can affect mechanosensing. Furthermore, with the help of computational modeling, we discovered that the viscoelastic properties of the substrate affect the forces subjected to cells, thereby influencing cellular mechanosensing.

In conclusion, this thesis describes the development of three new methods that enable mechanical stimulation and real-time detection of cell responses. With these methods, new insight was gained into the mechanisms that cells use to sense mechanical deformations at the cell-substrate interface, how the mechanical properties of the cell’s environment affect mechanosensing, and how the heterogeneity of epithelial monolayers is utilized for tissue-wide mechanoadaptation.