Multiplexed serological assay to study antibody responses against the enterovirus proteome

Abstract

Enteroviruses are one of the most common human pathogens, and they belong to the Picornavirus family. Their genus comprises numerous species and serotypes, including polio-, rhino-, coxsackie-, and echoviruses. They cause mainly acute infections that are often asymptomatic or lead only to mild flu-like symptoms. However, acute phases may also manifest into severe disorders, such as aseptic meningitis, or even persist long term within certain tissues, potentially contributing to chronic conditions, such as type 1 diabetes.

Enteroviruses have a unified structure that includes the single-stranded, positively charged RNA inside an unenveloped, spheroidal particle. Their genome encodes a polyprotein that consists of structural and non-structural proteins. The structural proteins form protective capsid around the genome. Non-structural proteins, in turn, participate in viral replication, for example by acting as proteases or helicases. Though the main roles of non-structural proteins are known, there is still much to discover. For example, their function in virus-host interactions and the immune response is still partly unclear. Currently, most serological assays applied to study immunological responses focus only on structural proteins, creating a notable gap in understanding of antibody responses to non‑structural proteins and providing a rationale for investigating their utility in serological assays.

This study focused on demonstrating the different antibody responses induced by the enterovirus structural and non-structural proteins, using a serological multiplex method. The aim was to produce and purify the coxsackievirus B structural proteins VP1-3 and non-structural proteins 2B, 3A, and 3D to supplement the Virology research groups´ existing proteins 2A, 2C, and 3C to complete the proteome, and test their utility in a multiplexed serological test. VP4 and 3B were ordered as peptides from Biomatic due to their small molecular weight. The proteins were produced in Escherichia coli cultures and chromatographically purified, followed by enzymatic biotinylation, utilizing a fused AviTag. The proteins were used as antigens in the commercial U-PLEX® assay platform from Meso Scale Discovery to measure antibody levels from plasma samples collected from the Finnish Type 1 Diabetes Prediction and Prevention study. The function of this enterovirus-panel was compared with previous infection datasets tested with the same samples.

The aims of this thesis were mostly achieved, as five of the six proteins were successfully produced in-house. The proteins were added to a 10-plex enterovirus-panel with previously generated coxsackievirus B antigens and used to assess infection profiles in a small set of plasma samples collected at birth until 36 months of age. As a result, a decrease in maternal antibodies was detected until 6 months of age, followed by peaks of antibody signals corresponding to the child’s own developing immune responses during enterovirus infections. These findings support earlier reports of the enteroviral proteins as potential biomarkers of acute infection. The enterovirus-panel covering the full proteome has strong potential as a versatile platform for future serological studies in multiple applications. While the results of this thesis demonstrate the promising performance of the included antigens, further research is needed to validate their broader applicability.

Enterovirukset kuuluvat Pikornaviruksiin ja ovat yleisiä ihmispatogeenejä. Ne käsittävät laajan joukon viruksia ja niiden serotyyppejä, mukaan lukien polio-, coxsackie-, rhino- ja echovirukset. Enterovirukset aiheuttavat pääasiassa akuutteja infektioita, jotka ovat usein oireettomia tai lieviä ja flunssankaltaisia. Infektiot voivat kuitenkin joissain tapauksissa johtaa myös vakavampiin tautimuotoihin, kuten aivokalvontulehdukseen, tai pitkittyä tietyissä kudoksissa mahdollisesti edistäen kroonisten sairauksien, kuten tyypin 1 diabeteksen, syntyä.

Enteroviruksilla on yhtenäinen rakenne, johon kuuluu yksijuosteinen, positiivisesti varautunut RNA vaipattoman kuoren sisällä. Niiden genomin koodaama polyproteiini koostuu rakenne- ja ei-rakenneproteiineista. Rakenneproteiinit muodostavat genomin ympärille suojaavan kuoren. Ei-rakenneproteiinit osallistuvat puolestaan muun muassa viruksen replikaatioon toimimalla esimerkiksi proteaaseina tai helikaaseina. Vaikka ei-rakenneproteiinien toiminnot tunnetaan pääpiirteittäin, niiden tarkempi rooli esimerkiksi virus-isäntä vuorovaikutuksissa ja immuunivasteessa on edelleen osittain epäselvä. Tällä hetkellä useimmat immunologisiin vasteisiin keskittyvät serologiset tutkimukset pohjautuvat ainoastaan rakenneproteiineihin. Tämä jättää merkittävän aukon ei-rakenneproteiineihin kohdistuvien vasteiden ymmärryksessä ja korostaa tarvetta tutkia niiden hyödyntämistä serologisissa tutkimuksissa.

Tämä tutkimus keskittyi osoittamaan enterovirusten rakenne- ja ei-rakenneproteiinien erilaisia vasteita serologista multiplex-menetelmää käyttäen. Tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa coxsackievirus B:n rakenneproteiinit VP1-3 ja ei-rakenneproteiinit 2B, 3A ja 3D täydentämään Virologian tutkimusryhmän olemassa olevia proteiineja 2A, 2C ja 3C, niin että aikaansaadaan koko proteomin kattava paneeli. VP4 ja 3B tilattiin Biomaticilta niiden pienen molekyylikoon vuoksi. Proteiinit tuotettiin Escherichia coli -viljelmissä ja puhdistettiin kromatografisesti, minkä jälkeen ne biotinyloitiin entsymaattisesti käyttämällä fuusioitua AviTag-peptiditunnistetta. Tuotettuja proteiineja käytettiin antigeeneinä Meso Scale Discovery:n kaupallisessa U-PLEX®-alustassa vasta-ainetasojen mittaamiseen plasmanäytteistä, jotka olivat peräisin Finnish Type 1 Diabetes Prediction and Prevention -tutkimuksesta. Täydellisen proteomipaneelin toimintaa arvioitiin vertaamalla tuloksia ryhmän aiempiin enterovirus-tuloksiin samoista plasmanäytteistä.

Tämän opinnäytetyön tavoitteet saavutettiin pääosin, sillä viisi kuudesta proteiinista tuotettiin onnistuneesti itse. Ne lisättiin 10 analyytin enteroviruspaneeliin täydentämää jo aiemmin tuotettuja coxsackievirus B antigeeneja ja paneelia käytettiin infektioprofiilien tarkasteluun pienessä plasmanäyteaineistossa, joka kattoi ajan syntymästä 36 kuukauden ikään asti. Tuloksena äidin vasta-aineiden havaittiin vähenevän noin kuuden kuukauden ikään asti, minkä jälkeen nousut vasta-ainetasoissa havainnollistivat lapsen omaa kehittyvää immuunivastetta enterovirusinfektioiden aikana. Nämä tulokset tukevat aiempia löydöksiä enterovirusproteiineista potentiaalisina akuutin infektion biomarkkereina. Koko enterovirusproteomin kattava paneeli mahdollistaa sen käytön monipuolisena alustana tuleville serologisille tutkimuksille eri käyttötarkoituksissa. Vaikka tämän työn tulokset osoittavat näiden antigeenien lupaavan toimivuuden, niiden laajemman hyödynnettävyyden varmistaminen vaatii jatkotutkimuksia.