Characterization and Therapeutic Targeting of Mycobacterial Biofilms

Abstract

Tuberkuloosi ja muut mykobakteeri-infektiot muodostavat edelleen merkittävän maailmanlaajuisen terveysongelman vaikean hoidettavuutensa vuoksi. Mykobakteerien kyky muodostaa biofilmejä, järjestäytyneitä bakteeriyhteisöjä, joita ympäröi antibiooteilta ja immuunipuolustukselta suojeleva soluväliaine, vaikuttaa merkittävästi niiden kykyyn sietää antibiootteja. Tässä väitöskirjassa tutkittiin mykobakteeribiofilmien ominaisuuksia ja terapeuttisia heikkouksia käyttäen <i>Mycobacterium marinum</i> -malliorganismia. Tavoitteena oli tutkia biofilmien koostumusta ja mekanismeja, jotka voivat liittyä bakteerien antibioottiensietokykyyn. Ensimmäisessä osatyössä selvitettiin <i>M. marinum</i> -biofilmien pintaproteomi pintabiotinoinnin ja massaspektrometrian avulla. Tulokset paljastivat useita runsaasti esiintyviä ja helposti saavutettavia pintaproteiineja, kuten GroEL1 ja GroEL2, jotka validoitiin nanobody-sitoutumiskohteiksi sekä <i>in vitro</i> biofilmeissä, että <i>ex vivo</i> granuloomissa. Nämä havainnot luovat pohjan molekyylitason kohdennetuille hoitomenetelmille, joiden avulla lääkkeitä voidaan suunnata tarkasti biofilmeissä eläviin bakteereihin.

Toisessa osatyössä tutkittiin soluväliaineen roolia antibiootinsietokyvyssä analysoimalla Δ<i>epsH</i>-mutanttia, joka tuottaa normaalia enemmän soluväliainetta. Mutantilla havaittiin kohonneet määrät solunulkoista DNA:ta ja proteiineja, mikä johti paksumpaan soluväliaineeseen ja suurempaan biofilmimassaan. Lisäksi mutantin havaittiin sietävän antibiootteja paremmin seeprakalamallissa. Tämä korostaa soluväliaineen tasapainon merkitystä antibiootinsietokyvyn säätelyssä.

Kolmannessa osatyössä arvioitiin lämpökäsittelyn käyttöä antibioottihoidon tehostajana. Subletaaleille lämpötiloille altistaminen lisäsi merkittävästi rifampisiinin tehoa <i>M. marinum</i> -biofilmeissä ja <i>ex vivo</i> -granuloomissa. Pidempien altistusten havaittiin vahvistavan tätä vaikutusta. Lämpö myös paransi streptomysiinin tehoa Mtb-biofilmeissä. Tulokset osoittavat, että hallittu lämpöstressi voi herkistää mykobakteereja antibiooteille ja tarjota tulevaisuudessa skaalautuvan lähestymistavan paikallistettuun hoitoon.

Kaiken kaikkiaan tutkimus selvittää mykobakteeribiofilmien heikkouksia, joita voidaan hyödyntää antibioottihoidon tehostamisessa. Yhdistämällä biofilmeihin kohdennettavat strategiat ja fysikaaliset hajotusmenetelmät, tämä työ tarjoaa uusia näkökulmia biofilmeihin liittyvän persistenssin vähentämiseen ja luo pohjaa uusille hoitomenetelmille antibioottiresistenssin aikakaudella.

Tuberculosis and other mycobacterial infections remain a major global health burden due to their chronic and treatment-resistant nature. A central contributor to this persistence is the ability of mycobacteria to form biofilms which are structured bacterial communities encased in an extracellular matrix (ECM) that protects cells from antibiotics and host immune defences. This thesis investigates the composition and therapeutic vulnerabilities of mycobacterial biofilms using <i>Mycobacterium marinum</i> as a model organism. The overall goal was to identify structural and physiological features underlying antibiotic tolerance and to explore novel strategies that could enhance treatment efficiency.

First, the surface proteome of <i>M. marinum</i> biofilms was characterized using surface biotinylation and mass spectrometry. The study identified several abundant, accessible surface proteins, including GroEL1 and GroEL2, which were validated as nanobody-binding targets both <i>in vitro</i> and in <i>ex vivo</i> granulomas. These findings provide a foundation for molecular targeting approaches that could enable selective drug delivery to biofilm-associated mycobacteria.

Second, the role of extracellular matrix components in antibiotic tolerance was examined through analysis of an Δ<i>epsH</i> mutant strain that overproduces biofilm matrix. The mutant exhibited elevated levels of extracellular DNA and proteins, resulting in a thicker ECM and increased biofilm mass. In the zebrafish model, the strain demonstrated greater antibiotic tolerance. These findings highlight the importance of matrix balance in determining antibiotic tolerance.

Finally, the potential of heat treatment as a physical adjuvant to antibiotic therapy was evaluated. Sublethal temperatures significantly increased rifampicin-mediated killing in <i>M. marinum</i> biofilms and <i>ex vivo</i> zebrafish granulomas, with longer exposures further enhancing efficacy. Heat also potentiated streptomycin activity in Mtb biofilms. These results demonstrate that controlled thermal stress can sensitize mycobacteria to antibiotics and may offer a scalable strategy for localized treatment. Together, these findings reveal molecular and physical vulnerabilities in mycobacterial biofilms that could be exploited to enhance antibiotic performance. By studying molecular targeting and physical disruption, this work offers new insights into combating biofilm-associated persistence in mycobacteria and provides a conceptual framework for developing adjunct therapies against chronic bacterial infections in the era of rising antimicrobial resistance.