ECM-Mimetic Gallol Modified Hyaluronic Acid Matrix as an Alternative to Matrigel in Colorectal Cancer Organoid Culturing

Abstract

The worldwide prevalence of cancer diseases is rapidly increasing due to increased life expectancy while unhealthy lifestyles and diets also contribute. Due to this cancer related deaths are also increasing. Conventional cancer treatment options are often incapable to provide curative treatment. Colorectal cancers (CRC) are cancer diseases affecting colorectal tissue. According to world health organization CRCs were the third most common cancer type worldwide and second in cancer related premature deaths in 2022. This outlines the huge need for novel treatment options for CRCs and other cancers. The medical field is currently moving towards personalized medicine with individually designed cancer treatment plans. However, to achieve the goal of personalized medicine better understanding of cancer biology is needed. Also, an established testing platform is required to assess the efficiency and safety of these individualized treatment plans.

Patient derived organoids have the potential to bridge the current gap in the methods of cell technology and personalized medicine. Organoids are cellular structures that organize into complex three-dimensional shapes that resemble the tissue the cells originate from. They can capture the essential features of tissue microenvironment. Consequently, organoids can provide a more relevant tissue model when compared to conventional two-dimensional cell cultures. Thus, organoids established from patient derived cancer tissue could potentially provide a novel platform to test the efficiency and safety of the individualized cancer treatment plans in in vitro conditions. Organoid culture establishment requires a culture platform. In natural tissue extracellular matrix (ECM) is an important component of the tissue. It provides mechanical support for the cells while simultaneously it has a substantial role in regulating cellular function and organization due to different signalling modalities present in ECM structure. The culturing platform must fulfil these properties in adequate detail. Basement membrane extracts like Corning’s Matrigel are currently most widely used platform materials in the organoid field. Matrigel is extracted from murine tumours that produce ECM components. However, the use of Matrigel has many limitations including animal origin and large batch-to-batch variations outlining the need for novel culture platforms with non-animal origin and defined composition.

All-natural hyaluronic acid modified with gallol acid (HAGA) can provide an alternative to Matrigel in organoid culturing. HAGA can form hydrogels through photo-crosslinking mechanism when combined with natural vitamin B2 riboflavin and blue light exposure offering excellent spatiotemporal control of hydrogel solidification. This work assessed the possibility to replace Matrigel with HAGA-based culturing platform in CRC organoid culturing. First, the mechanical properties of Matrigel, HAGA and their composite hydrogels were assessed with rheological methods while the degradation behaviour of these hydrogels were examined in three different media. These experiments confirmed qualitatively similar mechanical properties and similar degradation kinetics in cell culture medium. Next, CRC organoid viability was assessed by culturing organoids in Matrigel and HAGA composite hydrogels. Compared to organoids cultured in Matrigel no major visual differences were observed in organoid growth and viability. Fluorescent staining for the live and dead cell was also used to confirm cell viability in composite hydrogels. Finally, a differential gene expression analysis was used to compare the gene expression levels of CRC organoids cultured in Matrigel and in composite hydrogels. Clear increase in expression levels of stem cell marker genes OCT4, SOX2 and NANOG was observed in composite hydrogels. Similar results have been obtained with hyaluronic acid-based culture platforms in previous works. Based on the results of this work it can be concluded that HAGA-based hydrogels provide a potential alternative to Matrigel as a CRC organoid culturing platform.

Syöpäsairauksien maailmanlaajuinen esiintyvyys kasvaa nopeasti pidentyneen eliniänodotteen myötä. Lisäksi epäterveelliset elämäntavat myötävaikuttavat syöpien kehittymiseen. Tämän seurauksena myös syöpiin liittyvät kuolemantapaukset lisääntyvät. Nykyisillä syövän hoitovaihtoehdoilla ei usein pystytä parantamaan sairautta. Kolorektaaliset syövät ovat paksu- ja peräsuolikudosten syöpiä. Maailman terveysjärjestön mukaan kolorektaaliset syövät olivat maailmanlaajuisesti kolmanneksi yleisin syöpätyyppi ja toiseksi yleisin syöpään liittyvien kuolemien syy vuonna 2022. Tämä korostaa tarvetta uusille hoitovaihtoehdoille kolorektaalisten, sekä muiden syöpien hoidossa. Lääketiede on siirtymässä kohti yksilöllistettyjä syövän hoitosuunnitelmia. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi tarvitaan kuitenkin vielä enemmän ymmärrystä syöpien biologiasta. Lisäksi yksilöllisten hoitosuunnitelmien tehokkuuden ja turvallisuuden arvioimiseksi tarvitaan vakiintunut testausalusta.

Potilaalta peräisin olevilla organoideilla on potentiaalia kuroa umpeen nykyinen kuilu soluteknologian menetelmien ja yksilöllistetyn lääketieteen välillä. Organoidit ovat solurakenteita, jotka muodostavat monimutkaisia kolmiulotteisia rakenteita muistuttaen alkuperäistä kudosrakennetta, josta solut ovat peräisin. Näin organoidit kykenevät jäljittelemään keskeisiä kudosten mikroympäristön ominaisuuksia. Tämän vuoksi organoidit tarjoavat biologisesti merkityksellisemmän kudosmallin perinteisiin kaksiulotteisiin soluviljelmiin verrattuna. Siten potilaalta peräisin olevat syöpäorganoidit voisivat tarjota uuden alustan yksilöllistettyjen syövän hoitosuunnitelmien tehokkuuden ja turvallisuuden testaamiseksi in vitro -olosuhteissa. Organoidien viljely edellyttää sopivaa viljelyalustaa. Luonnollisessa kudoksessa soluväliaine on tärkeä osa kudosta. Se tarjoaa soluille mekaanista tukea ja sillä on merkittävä rooli solujen toimintojen ja järjestäytymisen säätelyssä soluväliaineessa esiintyvien signalointimekanismien avulla. Viljelyalustan on kyettävä jäljittelemään näitä ominaisuuksia riittävällä tarkkuudella. Tyvikalvouutteet, kuten Corningin Matrigel, ovat tällä hetkellä laajimmin käytössä olevia viljelyalustamateriaaleja organoidien viljelyssä. Matrigel eristettään hiiriperäisestä kasvainkudoksesta, joka tuottaa soluväliaineen komponentteja. Matrigelin käyttöön liittyy kuitenkin useita rajoituksia, kuten eläinperäinen alkuperä sekä suuret eräkohtaiset vaihtelut. Tämä korostaa tarvetta uusille tarkasti määritellyn koostumuksen omaaville viljelyalusteille, jotka eivät ole eläinperäisestä lähteestä.

Täysin luonnollinen gallushapolla modifioitu hyaluronihappo (HAGA) voi tarjota vaihtoehdon Matrigelille organoidien viljelyssä. HAGA mahdollistaa hydrogeelien muodostuksen valoaktivoidun silloittumisen avulla, kun siihen sekoitetaan luonnollista B2-vitamiinia ja seos altistetaan sinivalolle. Kyseinen mekanismi mahdollistaa erinomaisen spatiotemporaalisen kontrollin hydrogeelien kiinteytymisessä. Tässä työssä arvioitiin mahdollisuutta korvata Matrigel HAGA-pohjaisella viljelyalustalla kolorektaalisyöpäorganoidien viljelyssä. Ensin Matrigelin, HAGA:n ja niiden yhdistelmähydrogeelien mekaanisia ominaisuuksia tutkittiin reologisilla menetelmillä, sekä näiden hydrogeelien hajoamiskäyttäytymistä tarkasteltiin kolmessa eri väliaineessa. Kokeet osoittivat laadullisesti samankaltaiset mekaaniset ominaisuudet, sekä hajoamiskinetiikan soluviljelyväliaineessa eri hydrogeelien kesken. Seuraavaksi kolorektaalisyöpäorganoidien elinkelposuutta arvioitiin viljelemällä niitä Matrigelissä, sekä sen ja HAGA:n yhdistelmähydrogeeleissä. Merkittäviä visuaalisia eroja organoidien elinkelpoisuudessa ja kasvussa ei havaittu. Elävien ja kuolleiden solujen fluoresoivaa värjäystä käytettiin solujen elinkelpoisuuden varmistamiseksi yhdistelmähydrogeeleissä. Lopuksi differentiaalista geeniekspressioanalyysiä käytettiin vertaamaan Matrigelissä ja yhdistelmähydrogeeleissä viljeltyjen organoidien geeniekspressiotasoja. Tulokset osoittivat selkeän nousun kantasolumerkkigeenien OCT4, SOX2 ja NANOG ilmentymisessä yhdistelmähydrogeeleissä. Tämän työn tulosten perusteella voidaan todeta, että HAGA-pohjaiset hydrogeelit tarjoavat potentiaalisen vaihtoehdon Matrigelille organoidien viljelysalustana.