Mimicking the Liver Microenvironment : 3D Culturing, Organ-on-Chips, and Oxygen Regulation as Strategies to Improve iPSC-Derived Hepatocyte Maturation

Abstract

Maksa on ihmisen suurin sisäelin ja se on vastuussa useista kehon toiminnoista, kuten lääkkeiden ja toksiinien metaboloinnista, tehden siitä erityisen tärkeän elimen <i>in vitro</i> -malleilla mallinnettavaksi. Uusia, aiempaa kehittyneempiä ja fysiologisesti relevantimpia mallinnusmenetelmiä, kuten kolmiulotteisia (3D) sferoideja, yhteisviljelmiä ja kudossiruja on pyritty kehittämään, jotta esimerkiksi lääkeaineiden kehitykseen ja tautimallinukseen liittyvät tulokset olisivat entistä tarkempia ja ennustaisivat maksassa tapahtuvia mahdollisia reaktiota aiempaa paremmin.

2000-luvun alun läpimurto, somaattisten solujen uudelleenohjelmointi takaisin monikykyiseen tilaan, toi käytännössä rajattoman solulähteen tieteen käyttöön. Uudelleenohjelmoidut monikykyiset kantasolut (eng. induced pluripotent stem cell, iPSC) voidaan erilaistaa muiksi solutyypeiksi, kuten maksasolujen, hepatosyyttien, kaltaisiksi soluiksi (eng. hepatocyte-like cell, HLC). Tämä edistysaskel on vienyt maksatutkimusta eteenpäin ratkaisemalla ihmisen primaarien hepatosyyttien (eng. primary human hepatocyte, PHH) niukan saatavuuden, ja ohittamalla eettiset kysymykset, jotka liittyvät alkion kantasolujen käyttöön. iPSC-HL-solut ilmentävät usein kuitenkin sikiön soluille tyypillistä fenotyyppiä, jonka toiminnallisuus ja kypsyys ovat PHH-soluihin verrattaessa alentunut. Tässä väitöskirjassa pyrin selvittämään, kuinka maksan <i>in vitro</i> -mikroympäristön eri osa-alueiden muokkaaminen voi parantaa iPSC-HL-solujen erilaistumista ja edistää niiden kypsymistä.

Tuloksemme osoittavat, että 3D-iPSC-HLC-sferoidien toiminnallisuus ja viljelmien pitkäkestoisuus ovat parempia verrattuna perinteisiin 2D-viljelmiin, korostaen viljelytavan kolmiulotteisuuden tärkeyttä solujen välisen vuorovaikutuksen edistämisessä ja luonnollisen solupolarisaation ylläpitämisessä. Lisäksi arvioimme useita erilaisia biomateriaaleja 3D-kudossiruviljelyn ja iPSC-HL-solujen toiminnallisuuden tukemisen mahdollistamiseksi. Geeniekspressiodatan ja muiden tulosten perusteella Geltrex ja fibriini osoittautuivat sopiviksi vaihtoehdoiksi. Molemmat materiaalit osoittivat vain vähäistä hajoamista (fibriinin kohdalla, kun solukasvatusnesteeseen lisättiin aprotiniinia) ja tukivat solujen elinkelpoisuutta koko viljelyjakson ajan. Lisäksi mesenkymaalista alkuperää olevien solutyyppien sisällyttäminen kudossiruviljelmiin paransi iPSC-HL-solujen toiminnallisuutta näkyen kohonneena maksaspesifisten geenien ja proteiinien ilmentymisenä.

Samankaltaista toiminnallisuuden kehitystä havaittiin, kun iPSC-HL-soluja viljeltiin maksaliuska-kudossirulla (eng. Liver-Lobule-on-Chip, LLoC), joka yhdistää <i>in vivo </i> -maksakudosta jäljittelevän mikroarkkitehtuurin jatkuvaan, pumpulla aikaansaatuun solukasvatusnesteen perfuusioon. LLoC- ja 2D-kontrolliviljelmien immunosytokemialliset värjäykset osoittivat selviä eroja kypsien hepatosyyttimarkkereiden ilmentymisessä: LLoC-viljelmien solut olivat erilaistuneet paremmin. Huomionarvoista on, että viljelyjakson lopussa havaittiin solujen vyöhykemäistä organisoitumista, joka muistutti hepatosyyttien anatomista ja toiminnallista järjestäytymistä <i>in vivo</i>. Nämä tulokset korostavat, kuinka tarkka fysiologisen ympäristön jäljittely voi ohjata iPSC-HL-solujen erilaistumista kohti kypsyneempää fenotyyppiä.

Ilmakehän happitasot ja standardi-inkubaattoriolosuhteet (19–21 % O₂) ovat huomattavasti korkeampia kuin maksassa luonnollisesti esiintyvät 5-10% happitasot. Tämän luonnostaan esiintyvän happigradientin jäljittelemiseksi iPS-soluja viljeltiin kaupallisilla alustoilla, jotka mahdollistivat fysioksian (fysiologisesti oikeiden happitasojen) luomisen iPSC-HLC-viljelmiin. Maksaspesifisissä toiminnoissa, kuten albumiinin ja urean erityksessä, havaittiin huomattavaa kasvua, mikä osoittaa, että oikein ajoitettu fysioksia erilaistumisprosessin aikana voi merkittävästi parantaa iPSC-HL-solujen kypsyyttä. Mielenkiintoista on, että jotkin vyöhykespesifiset toiminnot olivat kohonneet samoissa koeolosuhteissa, mikä viittaa ennemmin yleisesti parantuneeseen toiminnallisuuteen kuin vyöhykespesifisten solupopulaatioiden syntyyn.

Kokonaisuudessaan tämän tutkielman havainnot korostavat fysiologisen mikroympäristön jäljittelyn tärkeää asemaa <i>in vitro</i> -maksamallinnuksessa. Useat testatut menetelmät, kuten 3D-sferoidiviljely, yhteisviljelmät, mikrofluidiset alustat, solukasvatusnesteen perfuusio ja fysioksiset olosuhteet, vaikuttivat iPSC-HL-solujen erilaistumistehokkuuteen parantaen niiden kypsyyttä. Eniten solujen erilaistumiseen vaikuttaneen yksittäisen tekijän tunnistaminen on haastavaa, sillä ne toimivat usein yhteistyössä toistensa kanssa. Väitöskirjan tulokset korostavatkin yleisesti näiden ympäristöelementtien integroinnin merkitystä <i>in vitro</i> -maksamallien relevanssin ja siirrettävyyden parantamiseksi.

As a central organ for metabolic functions, as well as the primary site for the processing of pharmaceuticals and toxins, the liver is frequently modelled <i>in vitro</i>. To achieve more physiologically relevant models that could provide more accurate and predictive results for drug development and disease research, novel approaches such as three-dimensional (3D) cell aggregates, co-culture systems and organ-on-chip (OoC) platforms, have been developed.

The breakthrough discovery of somatic cell reprogramming into a pluripotent state in the early 21st century introduced an essentially unlimited cell source, induced pluripotent stem cells (iPSCs), which can be differentiated into other cell types including hepatocyte-like cells (HLCs). This advancement has propelled liver research forward by overcoming the scarce availability of primary human hepatocytes (PHH) and bypassing ethical concerns associated with embryonic stem cells (ESCs). However, iPSC-HLCs often exhibit a foetal-like phenotype with reduced functionality and maturity compared to PHHs. In this thesis, I aim to explore how modifying different aspects of the <i>in vitro</i> microenvironment can enhance the differentiation and promote the maturation of iPSC-HLCs.

Firstly, our results demonstrate that 3D iPSC-HLC spheroids exhibit enhanced functionality and prolonged culture longevity in comparison to conventional 2D cultures, highlighting the critical role of culture dimensionality in promoting cell-cell interactions and maintaining natural cellular polarisation. To enable 3D on-chip culturing, various biomaterials were evaluated to identify the most suitable hydrogel for supporting iPSC-HLC functionality and culture dimensionality. Based on our gene expression data, albumin secretion results and practical handling considerations, Geltrex and fibrin emerged as suitable candidates. Both materials exhibited minimal gel degradation, fibrin when supplemented with aprotinin, and supported cell viability throughout the culture period. Moreover, incorporating cell types of mesenchymal origin into multilineage on-chip cultures improved iPSC-HLC functionality, as evidenced by elevated expression of liver-specific genes and proteins.

Similar improvements in functionality were observed when iPSC-HLCs were cultured on Liver-Lobule-on-Chip (LLoC) chip devices, which incorporate structural <i>in vivo</i> liver microarchitecture with continuous, pump-driven media perfusion. Immunocytochemical staining of LLoC and 2D control cultures revealed pronounced differences in the expression of mature hepatocyte markers, with LLoC cultures exhibiting a more mature phenotype. Notably, zonation-like patterns, resembling the anatomical and functional organisation of hepatocytes <i>in vivo</i>, were observed at the end of the culture period. These results underscore how high physiological mimicry of the culture environment can guide the differentiation of iPSC-HLCs towards more mature phenotype.

To mimic the in vivo oxygen conditions of the liver, which exhibit naturally occurring oxygen gradient with much lower oxygen levels compared to atmospheric oxygen levels and standard incubator conditions (19-21% O2), iPSCs were cultured on commercial 1-well platforms enabling us to establish physiologically accurate oxygen (5-10% O2) levels within the iPSC-HLC cultures. Significant increases in liver-specific functions, albumin and urea secretion, were measured, indicating that correctly timed physioxia during the differentiation process can greatly enhance the maturity of iPSC-HLCs. Interestingly, some zone-specific functions were upregulated within the same conditions, indicating generally enhanced hepatic functionality rather than the emergence of zone-specific cell populations.

Overall, the findings of this thesis underscore the critical role of physiological mimicry in <i>in vitro</i> liver modelling. Several factors, such as 3D spheroid culture, co-culture systems, microfluidic platforms, media perfusion, and physioxic conditions, were shown to influence iPSC-HLC differentiation efficiency and improve their maturity. Although it is challenging to identify a single most effective modification due to their interrelated nature, the results collectively highlight the importance of integrating these elements to enhance relevance of <i>in vitro</i> liver models and their translatability.