Cardiac Ischemia On-a-Chip Using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes : Modelling Ischemic Arrhythmogenesis and Cardioprotection with Levosimendan and OR-1896, alongside Fatty Acid Substrate Strategies for Structural and Metabolic Maturation

Abstract

Iskeeminen sydänsairaus (IHD) on edelleen johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti, ja akuutti sydäninfarkti (AMI) sekä siihen liittyvät komplikaatiot aiheuttavat merkittävää sairastavuutta ja terveydenhuollon kuormitusta. Aikuisten kardiomyosyyttien rajallinen uusiutumiskyky iskeemisen vaurion jälkeen johtaa usein palautumattomiin vaurioihin, hengenvaarallisiin rytmihäiriöihin ja etenevään sydämen vajaatoimintaan. Vaikka invasiiviset hoidot ovat kehittyneet, nykyiset lääkehoidot eivät pysty tehokkaasti estämään sydänlihassolujen menetystä ja sähköistä epävakautta sydäninfarktin jälkeen. Eläinmalleja on perinteisesti käytetty sydänsairauksien tutkimuksessa, mutta niiden tulkittavuus ihmisfysiologian kannalta on rajoitettua. Ihmisperäiset erittäin monikykyisistä kantasoluista johdetut sydänsolut (hiPSC-CMs) tarjoavat lupaavan, ihmisperäisen <i>in vitro </i>-mallin sydänpatofysiologian tutkimiseen ja uusien hoitomuotojen arviointiin.

Tässä tutkimuksessa kehitettiin ihmisestä tuotettuihin soluihin perustuva alusta, jossa käytettiin uudelleen ohjelmoiduista kantasoluista (iPS solut) tuotettuja sydänlihassoluja mallintamaan iskeemisen sydänsairauden patofysiologiaa, arvioimaan uusia terapeuttisia strategioita sekä parantamaan solujen kypsymistä taudin mallinnuksen tehostamiseksi.

Tutkimuksen päätavoitteena oli hyödyntää ihmisen iPS soluista tuotettuja sydänsoluja erityisesti uudessa laitteistossa, jossa happipitoisuutta voidaan säätää ja aiheuttaa iskemiaa (ischemia-on-a-chip-laitteisto) ja analysoida sydänlihassolujen toimintaa hypoksian/iskemian aikana. Lisäksi tutkimuksessa arvioitiin erään vajaatoimintalääkkeen, levosimendaanin ja sen aktiivisen metaboliitin OR-1896:n tehoa iskeemisten vaurioiden ehkäisyssä ja lievittämisessä. Aktiivisen metaboliitin lisääminen tutkimukseen oli tärkeää, koska se vastaa kliinisesti levosimendaanin vaikutuksesta ihmisessä. Tutkimuksessa selvitettiin myös eri metabolisten substraattien vaikutuksia hiPSC-CM-solujen kypsymiseen soluviljelyolosuhteissa.

Tavoitteiden saavuttamiseksi tässä väitöskirjassa oli useita osatavoitteita. Ensinnäkin luotiin ja karakterisoitiin <i>in vitro</i> -malli IHD:lle altistamalla kantasoluista tuotetut sydänsolut hypoksiselle stressille, ja todettiin mallin kykenevän jäljittelemään iskemian keskeisiä piirteitä solutasolla. Sydänsoluissa havaittiin merkittäviä rakenteellisia vaurioita, kuten sarkomeerien järjestymishäiriöitä ja mitokondrioiden harjanteiden fragmentaatiota, sekä lisääntynyttä sydänspesifisten biomarkkereiden vapautumista. Hypoksia lisäsi myös hypoksiavasteeseen, oksidatiiviseen stressiin ja apoptoosiin liittyvien geenien ilmentymistä, häiritsi kalsiumin säätelyä ja lisäsi rytmihäiriöiden esiintymistä.

Toiseksi arvioitiin levosimendaanin ja sen metaboliitin OR-1896:n rytmihäiriöitä estävää tehoa ja sydänsolujen rakennetta suojaavaa vaikusta iskemiamallissamme. Tulokset osoittivat, että nämä yhdisteet suojasivat solujen rakennetta, vähensivät biomarkkerien vapautumista ja vakauttivat kalsiumin kiertoa soluissa, mikä merkittävästi vähensi hypoksian aiheuttamaa rytmihäiriöherkkyyttä. Molemmat yhdisteet myös muokkasivat geeniekspressiota, laskien hypoksiavasteeseen ja oksidatiiviseen stressiin liittyvien geenien ilmentymistä sekä estäen apoptoosia. OR-1896 osoitti jopa verrattavissa tai paremmissa määrin suojaavia vaikutuksia kuin levosimendaani.

Lopuksi väitöskirjassa käsiteltiin tärkeää rajoitetta, joka liittyy ihmisen uudelleen ohjelmoitujen kantasolujen erilaistukseen ja kypsymiseen sydänlihassoluiksi (hiPSC-CM), eli sydänsolujen epäkypsää metabolista fenotyyppiä. Tutkimuksessa tarkasteltiin, kuinka soluviljelymediumin koostumus vaikuttaa solujen kypsymiseen. Solujen viljely rasvahappopitoisessa kasvatusliuoksessa paransi merkittävästi niiden rakenteellista, metabolista ja toiminnallista kehitystä, mikä johti sydänsolujen kypsempään, aikuisen kaltaiseen fenotyyppiin. Tämä erilaistumistapa tarjoaa käytännöllisen ja tehokkaan keinon parantaa ihmisen iPS soluista tuotettujen sydänlihassolujen fysiologista vastaavuutta prekliinisissä sovelluksissa, kuten tautimallinnuksessa, lääkkeiden seulonnassa ja regeneratiivisessa lääketieteessä.

Yhteenvetona, tämä väitöskirja tarjoaa laaja-alaisen tarkastelun ihmisen iPS soluista tuotettujen sydänlihassolujen käytöstä iskeemisen sydänsairauden mallintamiseen ja mahdollisten terapeuttisten interventioiden arviointiin. Tulokset korostavat iPS soluista tuotettujen sydänsolujen käyttökelpoisuutta sydänsairauksien solutason mekanismien tutkimisessa sekä prekliinisten lääketestien alustana. Levosimendaanin ja sen metaboliitin OR-1896:n osoitetut kardioprotektiiviset vaikutukset ihmisen kudosta vastaavassa <i>in vitro</i> -mallissa tarjoavat lupaavia näkökulmia uusien hoitostrategioiden kehittämiseksi. Lisäksi iPS soluista tuotettujen sydänsolujen kypsymistä koskeva tutkimus tukee fysiologisesti merkityksellisempien sydänmallien kehittämistä tulevaisuuden tutkimus- ja lääketestaukseen varten. Iskemialaitteiston, siihen liittyvä teknologian ja kantasolupohjaisten mallien yhdistäminen luo vahvan perustan tulevaisuuden lääketestaukseen ja yksilöllistettyyn hoidon kehittämiseen sydän- ja verisuonitautien alalla.

Ischemic heart disease (IHD) remains the leading cause of mortality globally, with acute myocardial infarction (AMI) and its subsequent complications contributing significantly to morbidity and healthcare burden. The limited regenerative capacity of adult cardiomyocytes (CMs) following ischemic injury often results in irreversible myocardial damage, culminating in arrhythmias and progressive heart failure. Although reperfusion therapies have improved patient outcomes, current pharmacological strategies remain insufficient in addressing CM loss and the resultant electrical instability. Moreover, the translational relevance of traditional animal models is limited by species-specific physiological differences, underscoring the need for more human-relevant in vitro models. Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) provide a promising platform for investigating cardiac disease mechanisms and evaluating new therapies.

This thesis establishes a comprehensive and physiologically relevant in vitro model that leverages hiPSC-CMs integrated with advanced ischemia-on-a-chip technology to simulate key aspects of ischemic heart disease, evaluate cardioprotective compounds, and explore strategies for enhancing cellular maturation.

The overarching aim of this research was to utilize hiPSC-CMs to investigate the impact of hypoxia on CM function and structure, assess the therapeutic potential of levosimendan and its active metabolite OR-1896, and improve the physiological maturity of hiPSC-CMs to enhance their application in disease modelling and drug screening.

To achieve these objectives, several specific approaches were pursued. First, a human-relevant ischemia model was established by subjecting hiPSC-CMs to controlled hypoxic stress within a microengineered platform. This model successfully recapitulated hallmark features of ischemic injury, including sarcomere disorganization, mitochondrial cristae fragmentation, and elevated cardiac biomarker release. Gene expression analyses revealed upregulation of hypoxia-responsive, oxidative stress, and apoptotic markers. Functional assays further demonstrated impaired calcium handling and an increased incidence of arrhythmic events.

Building upon this platform, the antiarrhythmic and cardioprotective properties of levosimendan and its metabolite OR-1896 were thoroughly evaluated. Treatment with these compounds preserved cellular architecture, reduced biomarker release, stabilized calcium transients, and significantly attenuated hypoxia-induced arrhythmogenesis. Both agents also modulated key stress-related gene expression pathways, while inhibiting apoptosis and improving mitochondrial function. Notably, levosimendan metabolite OR-1896 demonstrated cardioprotective effects that were comparable to, or in some aspects superior to, those of its parent compound, levosimendan.

Finally, the thesis addressed a critical limitation of hiPSC-CMs, which is their immature metabolic phenotype, by examining how the composition of the culture medium affects cellular maturation. Culturing the cells in a fatty acid-enriched medium significantly enhanced their structural, metabolic, and functional development, leading to a more adult-like phenotype. This approach offers a practical and effective method to improve the physiological relevance of hiPSC-CMs for preclinical applications in disease modelling, drug screening, and regenerative medicine.

In conclusion, this thesis provides a comprehensive exploration of ischemic heart disease using hiPSC-CMs in a human-relevant organ-on-a-chip platform. The findings offer compelling evidence for the cardioprotective potential of levosimendan and its metabolite OR-1896 under hypoxic conditions, while also advancing our understanding of cellular responses to ischemia. Moreover, the maturation strategy employed here enhances the translational relevance of hiPSC-CMs, contributing to the development of more predictive models for cardiovascular research and drug discovery. The integration of hiPSC technology with microphysiological systems holds great promise for future personalized medicine approaches, enabling high-throughput screening and patient-specific therapeutic development.