Bioactive Biomaterials for Urethral and Pelvic Floor Repair : Regenerative Potential of Ascorbic acid 2-phosphate-Releasing Poly-L-lactide-co-epsilon-caprolactone

Abstract

Virtsaputken vauriot ja lantionpohjan laskeumat voivat merkittävästi heikentää potilaiden elämänlaatua, ja niiden kirurginen hoito nykyisillä menetelmillä on haastavaa, eikä saatavilla ole ominaisuuksiltaan ihanteellisia korjausmateriaaleja. Perinteiset kirurgiset menetelmät ovat alttiita komplikaatioille tai vaurion uusiutumiselle. Erityisesti virtsaputken pidempien vaurioiden korjaaminen nykyisillä materiaaleilla on vaikeaa. Lantionpohjan laskeumien korjaamiseen aiemmin käytettyjen sulamattomien vaginaalisten polypropeeniverkkojen poistaminen markkinoilta on lisännyt tarvetta uusille tehokkaammille korjausmateriaaleille. Virtsaputken vaurioiden sekä lantionpohjan laskeumien hoitoon tarvitaan vaihtoehtoisia korjausmateriaaleja, jotka tukevat pehmytkudoksen muodostumista. Vaikka niiden taustalla olevat syntymekanismit eroavat toisistaan, ovat kudoksen uudistumisen vaatimukset osittain yhteneväiset. Kudosteknologian avulla voidaan kehittää uusia vaihtoehtoisia bioaktiivisia korjausmateriaaleja, jotka voivat tukea ja edistää normaalin kudoksen uudelleenrakentumista. Poly-L-laktidi-ko-epsilon- kaprolaktoni (PLCL) on biohajoava, elastinen polymeeri, jonka ominaisuudet tekevät siitä lupaavan materiaalin pehmytkudossovelluksiin. Askorbiinihappo 2-fosfaatti (A2P) on askorbiinihapon stabiili johdannainen, jonka on aiemmissa tutkimuksissa todettu edistävän solujen lisääntymistä, erilaistumista ja kollageenisynteesiä <i>in vitro</i>. A2P:n käyttöä bioaktiivisena komponenttina pehmytkudossovellusten kudosteknologisissa tukirakenteissa on kuitenkin toistaiseksi tutkittu erittäin vähän, eikä A2P:ta vapauttavia PLCL_A2P -tukirakenteita ole tutkittu koskaan aiemmin.

Tämä väitöskirja tutkii A2P:ta vapauttavien PLCL_A2P biomateriaalien vaikutusta solujen toimintaan ja kudoksen muodostumiseen. Tavoitteena on tutkia, miten PLCL_A2P -biomateriaalit vaikuttavat solujen kasvuun, toimintaan ja kollageenin tuotantoon ihmisen uroepiteelisoluissa (hUC), vaginan fibroblasteissa (hVF) ja rasvan kantasoluissa (hASC) <i>in vitro</i>, sekä miten PLCL_A2P vaikuttaa kudoksen muodostumiseen <i>in vivo</i> rottamallissa. ASC-soluja tutkittiin mahdollisena solutyyppinä tukemaan virtsaputken stroomakudoksen muodostumista sekä vaihtoehtoisena solutyyppinä primaarisille hVF-soluille lantionpohjan sovelluksiin. PLCL_A2P biomateriaaleihin lisätyn A2P:n odotetaan edistävän solujen jakaantumista ja kypsymistä sekä kollageenisynteesiä, mikä voisi puolestaan tehostaa kudosten vahvistumista <i>in vivo.</i> Ylikriittisellä hiilidioksidilla huokoistettuja scPLCL_A2P tukirakenteita tutkittiin virtsaputkisovelluksiin <i>in vitro</i>, ja PLCL_A2P kalvoja lantionpohjan sovelluksiin sekä <i>in vitro</i> että <i>in vivo</i>. Solujen toimintaa analysoitiin elinkyky- ja solujen lisääntymisanalyyseillä, Sircol kollageenianalyysillä, qRT- PCR:llä, fluoresenssivärjäyksillä sekä SEM-kuvantamisella. Kudoksen rakentumista <i>in vivo</i> analysoitiin vetokokeilla sekä histologisilla värjäyksillä.

<i>In vitro</i> -tutkimukset osoittivat, että PLCL_A2P biomateriaalit olivat bioyhteensopivia, tukivat hUC-solujen fenotyyppiä ja lisäsivät merkittävästi hASC- ja hVF-solujen lisääntymistä ja kollageenin tuotantoa. PLCL_A2P tuki hUC-solujen kasvua ja fenotyyppiä yksittäis- ja hUC/hASC yhteisviljelmissä, vaikka yhteisviljelmän tutkimusasetelma ei ollutkaan optimaalinen. PLCL_A2P lisäsi merkittävästi hASC- solujen lisääntymistä ja kollageenisynteesiä sekä ylläpiti niiden lihaserilaistumispotentiaalia. Myös hVF-solujen lisääntyminen ja kollageenisynteesi lisääntyivät merkittävästi PLCL_A2P biomateriaaleilla edistäen erityisesti tyypin I kollageenin tuotantoa solun ulkoiseen tilaan. Lisäksi <i>in vivo</i> -tutkimukset osoittivat, että PLCLA2P edisti kudoksen kollageenin muodostumista ja kudoksen vahvistumista lisäämättä kuitenkaan kudoksen jäykkyyttä. Nämä havainnot tukevat PLCL_A2P biomateriaalien potentiaalia vaihtoehtoisina korjausmateriaaleina sekä virtsaputken sovelluksiin että lantionpohjan laskeumien korjaamiseen edistämällä kudoksen muodostumista ja lisäämällä kollageenin tuotantoa. Tämä väitöskirja oli ensimmäinen, jossa tutkittiin uusia PLCL_A2P biomateriaaleja, joten laajempia jatkotutkimuksia tarvitaan selvittämään niiden tarkempia vaikutuksia solujen toimintaan, kudosten muodostumiseen pidemmällä aikavälillä, ja etenkin PLCL_A2P biomateriaalien aiheuttamia immuunivasteita in vivo tulevaisuuden kliinistä käyttöä varten.

Urethral defects and pelvic organ prolapses (POP) can significantly decrease patients’ quality of life, yet both conditions still lack optimal repair materials for surgical repair. Conventional surgical methods are prone for complications or recurrences. Longer urethral defects lack optimal graft materials to regenerate functional urethra. For POP, market withdrawal of the widely utilized nonabsorbable polypropylene vaginal meshes created a critical need for alternative repair materials. Therefore, new effective repair materials are needed. These both conditions represent tissue defects where supportive biomaterials that promote soft tissue regeneration are needed. While their pathogenesis differs, the regenerative requirements partially overlap. Tissue engineering can provide promising alternatives by developing bioactive materials that support functional tissue regeneration. Poly-L- lactide-co-epsilon-caprolactone (PLCL), is a biodegradable, elastic polymer with a potential for soft tissue applications. Ascorbic acid 2-phosphate (A2P), a stable derivative of ascorbic acid, has been shown to promote cell proliferation, differentiation, and collagen synthesis <i>in vitro</i>. However, its use as a scaffold- embedded bioactive component for soft tissue engineering is underexplored, and A2P-embedded PLCL scaffolds have not been previously investigated.

This thesis investigates the effect of A2P-releasing PLCL_A2P biomaterials on cellular behaviour and tissue regeneration. The aim is to evaluate how PLCLA2P biomaterials influence cell growth, function, and collagen production in human urothelial cells (hUCs), vaginal fibroblasts (hVFs), and adipose-derived stem/stromal cells (hASCs) <i>in vitro</i>, as well as their effect on tissue regeneration in an <i>in vivo</i> rat model. ASCs were studied for their potential to support urethral stromal regeneration and as an alternative cell type for primary hVFs in cell-seeded grafts for POP applications. Embedded A2P is hypothesized to enhance collagen synthesis, cell proliferation and maturation, which could also lead to enhanced tissue strength <i>in vivo</i>. Supercritical CO2-foamed scPLCL_A2P scaffolds were studied <i>in vitro</i> for urethral applications, and PLCL_A2P membranes for POP applications both <i>in vitro</i> and <i>in vivo</i>. Cell function was assessed with viability and proliferation assays, Sircol total collagen assay, qRT-PCR, fluorescent staining, and SEM-imaging. <i>In vivo</i> tissue regeneration was evaluated through tensile testing and histological assessments.

<i>In vitro</i> studies demonstrated that PLCL_A2P biomaterials were biocompatible, maintained hUC phenotype, and significantly promoted hASC and hVF proliferation and collagen production. PLCL_A2P supported hUC growth and phenotype in monoculture and hUC/hASC coculture and supported hASC growth in hUC/hASC coculture despite suboptimal coculture setup. In monoculture, PLCL_A2P significantly increased hASC proliferation and collagen production, and maintained their myogenic capabilities. Similarly, PLCL_A2P enhanced hVFs proliferation and collagen production, particularly promoting extracellular collagen type I maturation. <i>In vivo</i> studies further demonstrated that PLCL_A2P promoted collagen deposition and tissue strength without increasing tissue stiffness. These findings suggest that PLCL_A2P biomaterials are potential alternatives for urethral applications and POP repair for promoting tissue regeneration and enhancing tissue collagen production. However, as this research was the first to study the novel PLCL_A2P materials, future studies are needed to reveal further cellular effects, assess long-term tissue remodelling, and most critically, evaluate the elicited immune responses <i>in vivo</i> for future clinical translation.