In Vitro Recapitulation of the Limbal Stem Cell Niche : A mechanobiological perspective

Abstract

Silmän pinnalla sijaitsevan sarveiskalvon rakenteellinen eheys on olennainen tekijä hyvän näkökyvyn ylläpitämisessä. Tämän mahdollistaa sarveiskalvon uloimman solukerroksen epiteelin nopea uusiutuminen, jota ylläpitävät limbaaliset kantasolut (eng. limbal stem cell, LSC). Limbaalisten kantasolujen toiminnallisuutta säätelee niiden erityinen mikroympäristö eli niin kutsuttu kantasolulokero, joka sijaitsee limbaalisella alueella sarveiskalvon reunalla. Tämän herkän mikroympäristön häiriintyminen heikentää limbaalisten kantasolujen uusiutumiskykyä, johtaen pahimmillaan limbaalisten kantasolujen puutokseen (eng. limbal stem cell deficiency, LSCD). Tämän tilan hoitaminen edellyttää sekä toimivien LSC-solujen palauttamista silmään sekä niiden kantasolulokeron uudelleenrakentamista.

Ihmisen erittäin monikykyisistä kantasoluista (eng. human pluripotent stem cell, hPSC) erilaistetut limbaalisten kantasolujen kaltaiset solut (eng. human pluripotent stem cell derived limbal stem cell, hPSC-LSC) muodostavat lupaavan ja ehtymättömän solulähteen, minkä lisäksi ne mahdollistavat erilaisten alapopulaatioiden tuottamisen. Näiden solujen lääkinnällistä käyttöä varten liittyy kuitenkin vielä useita haasteita. Niistä merkittävin on kliinisesti relevanttien LSC- solujen tunnistamiseen liittyvät haasteet, mitkä johtuvat ensisijaisesti puutteellisesta ymmärryksestä solujen säätelymekanismeista sekä rajallisista tutkimusmenetelmistä, joilla voidaan tarkastella LSC-solujen ja niiden mikroympäristön välistä vuorovaikutusta in vivo. Tämän vuorovaikutuksen tutkiminen edellyttää siirtymistä perinteisistä kaksiulotteisista (2D) soluviljelyalustoista kohti kolmiulotteisia (3D) malleja, jotka jäljittelevät alkuperäistä kudosympäristöä huomattavasti tarkemmin.

Tämän väitöskirjan tavoitteena oli kehittää 3D in vitro -malli limbaalista kantasolulokeroa varten, jota voidaan käyttää LSC-solujen tutkimusalustana natiivia kudosta jäljittelevässä ympäristössä. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä hyödynnettiin kokonaisen kudospalan immunofluoresenssivärjäystä (eng. whole mount immunofluoresence) ihmisen luovuttajasarveiskalvoista sekä sian sarveiskalvoista LSC-solujen tarkan järjestäytymisen karakterisointiin in vivo sekä in vitro -mallikehityksen kontrolliksi. Seuraavassa osatyössä tutkittiin mekaanisen jäykkyyden ja limbaalisen alueen topografian vaikutusta hPSC-LSC-solujen fenotyyppiin ja käyttäytymiseen eri vaiheissa niiden erilaistumista. Viimeisessä osatyössä kehitettiin lokeroitu 3D in vitro -malli limbuksesta yhdistämällä perinteistä geelien valamista ja 3D-biotulostamista. Tässä hybridimenetelmässä hyödynnettiin hyaluronihappopohjaisia biomusteita, mitkä mahdollistivat fysiologisesti relevantin mekaanisen jäykkyyden luomisen rakenteeseen ekstruusiotulostamalla.

Tässä väitöskirjassa osoitettiin riittävän spatiaalisen resoluution ja kudosmateriaalin laadun olevan kriittisiä tekijöitä limbaalisten kantasolujen järjestäytymisen karakterisoinnissa in vivo. Lisäksi osoitettiin, että soluviljelyalustan mekaanisella jäykkyydellä on keskeinen rooli hPSC-LSC-solujen fenotyypin säätelyssä in vitro -olosuhteissa. Väitöskirjassa esitellään myös uusi lähestymistapa LSC-solujen kantasolulokeron mallintamiseen, missä hyödynnettiin sen mekaanisten ominaisuuksien jäljittelyä sekä LSC-solujen lokerointia. Yhdessä nämä edistysaskeleet luovat perustan LSC–solujen ja niiden mikroympäristön vuorovaikutusten tutkimiselle ja tukevat kliinisesti relevanttien kantasolupopulaatioiden kehittämistä soluterapeuttisiin sovelluksiin.

The maintenance of corneal integrity on the ocular surface is essential for preserving vision. This integrity is maintained by the rapid renewal of the corneal epithelium, the outermost layer of the cornea, which is driven by limbal stem cells (LSCs). The functionality of LSCs depends on a precisely regulated microenvironment called the niche, which is located in the limbus at the corneal periphery. Disruption of the limbal niche compromises the self-renewal capacity of LSCs and ultimately, leads to limbal stem cell deficiency (LSCD) which requires the revival of both functional LSCs and the limbal niche.

The differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into limbal stem cell- like cells (hPSC-LSCs) represents a promising and potentially unlimited source of LSCs, with the added advantage of enabling the generation of distinct cellular subpopulations. However, several challenges hinder the realization of their full therapeutic potential. From these, the most important one is a lack of a definitive molecular and functional identity for clinically relevant LSCs, largely due to limited understanding of the native regulatory mechanisms and insufficient tools to study niche–LSC interactions in vivo. To address this gap, there is a critical need to transition from traditional two-dimensional (2D) cultures on stiff plastic substrates to three-dimensional (3D) models that better replicate the native tissue environment. This dissertation focused on developing a 3D in vitro model of the limbus for studying LSC-niche interaction and behaviour in a native-tissue mimicking environment. Initially, whole-mount immunofluorescence (WM-IF) was employed on human donor and porcine corneas to characterize spatial organization of LSCs in vivo and to optimize reference controls for in vitro modelling. Subsequently, the influence of native tissue-mimicking stiffness and limbal topography on hPSC-LSC phenotype and behaviour was evaluated utilizing cells at various stages of differentiation. Finally, a compartmentalized 3D in vitro model of the limbus was successfully established using a hybrid strategy that combined traditional gel casting with 3D bioprinting.

In conclusion, this dissertation underscores the importance of high-resolution spatial mapping and tissue quality in characterizing LSC hierarchy and organization in vivo. Furthermore, the results of this dissertation highlight the critical role of matrix stiffness in regulating hPSC-LSC phenotype in vitro. Moreover, this dissertation presents a novel approach to modelling the limbal niche through the replication of its mechanical attributes and spatial compartmentalization of LSCs. Together, these advancements provide a foundational framework for studying LSC– niche interactions and support the development of clinically relevant LSC populations for therapeutic applications.