Carotenoid production of Xanthobacter sp. SoF1 strains

Abstract

This thesis investigates the impact of genetic modifications on carotenoid biosynthesis in Xanthobacter sp. SoF1 strains. The wild type SoF1 is known to exhibit a bright yellow-orange coloration due to the presence of the carotenoid zeaxanthin dirhamnoside, whereas the carotenoid pathway knockout strains SoF1 ∆crtY and SoF1 ∆crtE appear red and beige, respectively. This is assumed to be due to carotenoid biosynthesis stopping at the red carotenoid lycopene in SoF1 ∆crtY and the colourless carotenoid precursor farnesyl diphosphate in SoF1 ∆crtE. Carotenoids are secondary metabolites and pigments found across all domains of life, and previous research suggests that carotenoid deficiency in naturally carotenogenic bacteria may impair cellular fitness. Therefore, one objective of this study was to assess whether the knockout strains exhibit reduced fitness under continuous autotrophic cultivation. Another aim was to determine whether these strains retain their pigmentation and produce the expected carotenoids.

Although the knockout strains SoF1 ∆crtY and SoF1 ∆crtE had been constructed prior to this thesis, they retained the gene removal marker kansacB. Initial efforts focused on removing this marker, which was successful only for SoF1 ∆crtY. Consequently, bioreactor cultivations were conducted using strains that still contained the marker. The strains were cultivated continuously under autotrophic conditions at 8.5 L scale at a final dilution rate of 0.024 h-1. Growth was monitored via optical density and cell dry weight measurements, and the pigmentation of the cells was assessed visually and colorimetrically. Carotenoid production was assessed through UPLC-MS/MS and spectral analysis, while carotenoid precursors were quantified by LC-MRM/MS.

All strains demonstrated comparable growth, indicating that the knockouts did not compromise fitness under the tested conditions. Zeaxanthin dirhamnoside could not be quantified due to limitations in the used method, resulting in a lower-than-expected total carotenoid content of 2.7–4.0 mg/kg cell dry weight (CDW) in SoF1. However, based on absorption spectra, the overall carotenoid content in SoF1 was roughly estimated at 1000 mg/kg CDW. SoF1 ∆crtY produced 54 – 82 mg/kg CDW of the quantified carotenoids, predominantly the expected lycopene, while SoF1 ∆crtE produced only 0.27–0.31 mg/kg CDW, mainly phytofluene. Small quantities of unexpected carotenoids and precursors were detected in all strains, including capsorubin and echinenone, suggesting the possible presence of alternative biosynthetic pathways. Additionally, the carotenoid precursor geranylgeranyl diphosphate was detected in SoF1 ∆crtE despite the deletion of crtE, indicating a possible alternate route for its synthesis.

This thesis contributes to the understanding of carotenoid biosynthesis and its physiological relevance in SoF1. The findings highlight the complexity of carotenoid metabolism and suggest avenues for further research into alternative pathways and analytical methods for quantifying rare carotenoids. The work was commissioned by Solar Foods Oyj.

Tämän diplomityön tarkoituksena oli tutkia karotenoidien biosynteesireitille tehtyjen geenideleetioiden vaikutusta Xanthobacter sp. SoF1 -kantoihin. Luonnonvarainen SoF1 -kanta on kirkkaan oranssinkeltainen johtuen harvinaisesta karotenoidista zeaksantiini-dirhamnosidista. Karotenoidireitille tehdyn geenideleetion seurauksena saatu kanta SoF1 ∆crtY on punainen, kun taas SoF1 ∆crtE on beige. Karotenoidit ovat sekundäärimetaboliitteja ja pigmenttejä, joita esiintyy kaikissa eliökunnissa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että karotenoidien puute voi haitata kasvua bakteereissa, jotka normaalisti tuottavat niitä. Tämän vuoksi yksi tutkimuksen tavoitteista oli arvioida, heikentääkö geenideleetioiden aiheuttama karotenoidien puute tai muutos karotenoidiprofiilissa kantojen kasvukykyä jatkuvassa autotrofisessa kasvatuksessa. Lisäksi haluttiin selvittää, säilyykö kantojen pigmentaatio bioreaktorikasvatuksessa ennallaan, ja tuottavatko kannat odotettuja karotenoideja.

Geenideleetiokannat SoF1 ∆crtY ja SoF1 ∆crtE oli rakennettu ennen työn aloitusta, mutta niissä oli edelleen jäljellä geenideleetiomarkkeri kansacB. Työn ensimmäinen vaihe oli poistaa tämä markkeri, mikä onnistui vain SoF1 ∆crtY -kannassa. Tämän vuoksi bioreaktorikasvatuksissa käytettiin kantoja, joissa markkeri oli yhä jäljellä. Kasvatus toteutettiin autotrofisissa olosuhteissa 8.5 litran mittakaavassa laimennusnopeudella 0.024 h-1. Kasvua seurattiin mittaamalla optista tiheyttä ja solujen kuivapainoa, minkä lisäksi kantojen pigmentaatiota arvioitiin sekä visuaalisesti että kolorimetrisesti. Karotenoidien tuotantoa arvioitiin UPLC-MS/MS- ja spektroskooppisilla menetelmillä, minkä lisäksi karotenoidien prekursoreita mitattiin LC-MRM/MS-analyysillä.

Kantojen kasvussa ei havaittu merkittäviä eroja, mikä viittaa siihen, että geenideleetioilla ei ollut haitallista vaikutusta solujen kasvuun käytetyissä olosuhteissa. Zeaksantiini-dirhamnosidia ei voitu kvantifioida käytetyn menetelmän rajoitteiden vuoksi, minkä seurauksena SoF1-näytteiden mitattu karotenoidipitoisuus jäi odotettua alhaisemmaksi: 2.7–4.0 mg/kg kuivapainoa. Absorptiospektrin perusteella SoF1:n karotenoidipitoisuudeksi arvioitiin kuitenkin noin 1000 mg/kg kuivapainoa. Odotuksia vastaten SoF1 ∆crtY tuotti 54–82 mg/kg kuivapainoa karotenoideja, joista suurin osa oli lykopeenia. SoF1 ∆crtE tuotti karotenoideja vain 0.27–0.31 mg/kg kuivapainoa, pääosin fytoflueenia. Kaikissa kannoissa havaittiin myös pieniä määriä odottamattomia karotenoideja ja prekursoreita, kuten kapsorubiinia ja ekinenonia, mikä saattaa viitata vaihtoehtoisiin biosynteesireitteihin SoF1:ssa. Lisäksi karotenoidiprekursori geranyyligeranyylidifosfaattia havaittiin SoF1 ∆crtE -kannassa geenideleetiosta huolimatta, mikä voi viitata sen muodostumiseen toista reittiä pitkin.

Tämä diplomityö lisää ymmärrystä karotenoidien biosynteesistä ja niiden fysiologisesta merkityksestä Xanthobacter sp. SoF1:ssa. Tulokset korostavat karotenoidimetabolian monimutkaisuutta ja avaavat uusia tutkimusmahdollisuuksia vaihtoehtoisiin biosynteesireitteihin sekä harvinaisten karotenoidien, kuten zeaksantiini-dirhamnosidin, analyysimenetelmien kehittämiseen. Työ toteutettiin Solar Foods Oyj:n toimeksiannosta.