Dopamine and Gallol Functionalized Hyaluronic Acid Hydrogels : A formidable strategy to enhance stability and bioactivity

Abstract

Edistyneiden biomateriaalin kehittäminen kudostekniikan sovelluksiin on saanut merkittävää huomiota viimeisten vuosien aikana, erityisesti glykosaminoglykaaneihin perustuvat, soluväliainetta jäljittelevät hydrogeelit ovat olleet kiinnostuksen kohteena niiden erinomaisen bioyhteensopivuuden, biohajoavuuden ja säädettävien fysiokemiallisen ominaisuuksien ansiosta. Huolimatta merkittävistä kehitysaskeleista hydrogeelien kehityksessä, soluväliainetta jäljittelevät hydrogeelit eivät ole vielä saavuttaneet kudosmekaniikan vaatimia kliinisiä ominaisuuksia, säilyttäen samanaikaisesti biologisen aktiivisuutensa joka edistää kudoksen uusiutumista. Polyfenoliryhmät, kuten dopamiini (DA) ja gallushappo (GA), edustavat lupaavaa tutkimussuuntaa kudostekniikassa johtuen niiden erinomaisesta bioyhteensopivuudesta, biohajoavuudesta, mekaanisista ominaisuuksista ja kyvystä lievittää oksidatiivista stressiä. Tämä väitöskirja tutkii tässä kontektissa tällaisten hydrogeelien synteesiä, karakterisointia ja sovelluksia, keskittyen erityisesti niiden käyttöön regeneratiivisessa lääketieteessä.

Bioaktiivisten polyfenoliryhmien integrointi hyaluronaanipohjaiseen hydrogeelimatriisiin mahdollisti kolme erilaista sovellusta: immunomoduloivan, solukäyttäytymistä ohjaavan hydrogeelialustan suunnittelun, joka parantaa solujen kiinnittymistä ja lisääntymistä; aivokudosta jäljittelevän 3D-alustan kehittämisen, joka kykenee vangitsemaan solujen tuottaman ECM:n ja neurotrofiset tekijät, uudelleenmuotoilemaan matriisin ja tukemaan hermosolujen ulokkeiden kasvua; sekä hydratsonisidoksin ristisilloitetun biomusteen, jolla voidaan 3D-bioprintata sarveiskalvon strooman kaltaisia rakenteita ja joka osoitti erinomaista <i>ex-vivo</i> integraatiota isäntäkudokseen.

Tutkimme sekä teoreettisesti että kokeellisesti DA- ja GA-konjugoitujen hyaluronaanien kemiallisen reaktiivisuuden ja bioaktiivisuuden eroja, jotka johtuvat GA:n kemiallisessa rakenteessa olevasta ylimääräisestä hydroksyyliryhmästä. Sopivan ristisiloittajan läsnäollessa tämä ero mahdollistaa huomattavasti nopeamman ristisilloituksen verrattuna DA-modifioituun hyaluronaaniin. Tutkimuksemme osoitti, että polyfenolilla modifioidut hydrogeelit omaavat erinomaisen mekaanisen lujuuden ja rakenteellisen stabiilisuuden, johtuen niiden kyvystä muodostaa sekundääriverkkoja hydrogeelimatriisin sisälle - nämä ovat keskeisiä rakenteellisen eheyden säilyttämiselle biologisesti dynaamisissa ympäristöissä. Osoitimme, että matriisikoostumuksen lisäksi kovalenttisesti liitetty DA näyttelee keskeistä roolia solujen erittämien ECM-proteiinien vangitsemisessa. Tämä yhdistetty vaikutus mahdollisti aivokudosta jäljittelevän hydrogeelialustan suunnittelun, joka edistää hermosolujen ulokeverkoston muodostumista. DA:n erinomaiset fysikokemialliset ominaisuudet auttoivat meitä myös suunnittelemaan hyaluronaaniin ja kollageeniin perustuvan komposiittibiomusteen sarveiskalvon strooman regenerointiin. Tämä uusi lähestymistapa mahdollisti 3D-rakenteiden tulostamisen erinomaisella muodonpitävyydellä ilman yleisimmin käytettyä jälkikäsittelymenetelmää, valo- ristisilloitusta. Nämä soluja kapseloivat 3D-bioprintatut rakenteet osoittivat erinomaista integraatiota isäntäkudokseen <i>ex-vivo</i> -mallissa, raivaten näin tietä tulevaisuuden ihmisperäiselle sarveiskalvon uudistumistutkimukselle.

Siirron jälkeinen aggressiivinen immuunivaste on yksi keskeisimmistä haasteista biomateriaalitutkimuksen viemisessä onnistuneisiin kliinisiin sovelluksiin. Vaikka sekä DA- että GA-konjugoidut hyaluronaanit erilaistivat monosyyttejä makrofageiksi, GA-modifioitu hyaluronaani ilmensi voimakkaampia tulehdusta hillitseviä ominaisuuksia, mikä on ratkaisevaa kudosparanemisen kannalta. Tämän vuoksi suunnittelimme gallol-konjugoidun hyaluronaanihydrogeelin, joka ei ainoastaan osoittanut erinomaisia tulehdusta hillitseviä ominaisuuksia viljellyillä hiiren M1-makrofageilla ja ihmisen monosyyteillä, vaan myös tuotti immunosuppressiivisia myeloidisia soluja terveen hiiren ihonalaisessa implantissa. Nämä löydökset tarjoavat meille uuden ratkaisun immunosuppressiivisen ja mekaanisesti kestävän hydrogeelialustan suunnitteluun haavanhoidon ja kudoskorjauksen sovelluksiin.

Tässä väitöskirjassa esitetty tutkimustyö korostaa hyaluronaanipohjaisten hydrogeelien potentiaalia monipuolisina alustarakenteina. Työ tarjoaa merkittäviä uusia näkökulmia seuraavan sukupolven biomateriaalien kehitykseen hyödyntäen dopamiini- ja gallolirakenteiden moninaisia ominaisuuksia, raivaten tietä edistyneille ja luotettaville kudostekniikan ratkaisuille. Kaiken kaikkiaan tällaisten monitoimisten hydrogeelien suunnittelu edustaa mullistavaa lähestymistapaa biomateriaalien kehittämisessä, tarjoten huomattavia parannuksia bioyhteensopivuuteen, mekaaniseen suorituskykyyn ja terapeuttiseen tehokkuuteen.

The development of advanced biomaterials for tissue engineering has garnered significant attention in recent years, particularly glycosaminoglycan-based extracellular matrix (ECM) mimicking hydrogels due to their biocompatibility, biodegradability, and tuneable physicochemical properties. Despite major advancements in the field of hydrogel developments, such ECM-mimicking hydrogels are yet to meet the clinical needs of tissue mechanics while maintaining their biological efficacy that promotes tissue regeneration. Polyphenol groups such as dopamine (DA) and gallic acid (GA) present a promising frontier in tissue engineering due to their remarkable biocompatibility, biodegradability, mechanical properties, and mitigating oxidative stress. In this context, this doctoral thesis explored the synthesis, characterization, and application of such hydrogels, focusing on their utility in regenerative medicine. The integration of bioactive polyphenol groups within the hyaluronan based hydrogel matrix promoted three different applications; designing a cell-instructive immunomodulatory hydrogel scaffold that enhances cellular adhesion and proliferation, to develop a brain-mimetic 3D scaffold that can trap the cell-produced ECM, neurotrophic factors, can remodel the matrix and support the neurite outgrowth, and finally a hydrazone crosslinked bioink for 3D bioprinting corneal stromal equivalents that demonstrated excellent ex-vivo integration to host tissue.

We investigated both theoretically and experimentally the difference in chemical reactivity and bioactivity of DA and GA conjugated hyaluronan owing to the extra hydroxyl group present in the chemical structure of GA. This difference has a remarkable effect on facilitating faster crosslinking in the presence of a suitable crosslinker compared to DA-modified hyaluronan. Our research demonstrated that polyphenol-modified hydrogels exhibit superior mechanical strength and structural stability owing to their ability to form secondary networks within the hydrogel matrices, which are essential for maintaining scaffold integrity in dynamic biological environments. We demonstrated that along with the matrix composition, covalently grafted DA plays a key role in trapping cell-secreted ECM proteins. The combinatorial effect assisted in designing a brain-mimetic hydrogel scaffold that promotes neurite network formation. The superior physicochemical properties of DA also helped us to design a composite bioink based on hyaluronan and collagen for corneal stroma regeneration. The novel approach allowed us to print 3D structures with excellent shape fidelity without requiring photo-crosslinking as the most utilized post-processing approach. Those cell-encapsulated 3D-bioprinted constructs showed excellent host tissue integration in the <i>ex-vivo</i> model, thereby paving the path for future human cornea regeneration research.

One of the key bottlenecks of advancing biomaterials research into successful clinical outcomes is the aggressive immune response post-transplantation. Although both DA and GA conjugated hyaluronan differentiated monocytes to macrophages, GA- modified hyaluronan exhibited more anti-inflammatory characteristics which is key for tissue healing. We thus designed a gallol-conjugated hyaluronan hydrogel that not only showed excellent anti-inflammatory properties with cultured murine M1 macrophages and human monocytes but also recruited immunosuppressive myeloid cells in a subcutaneous implant of a healthy mice model. These findings offer us a new solution to design an immunosuppressive mechanically robust hydrogel scaffold for wound healing and tissue repair applications.

The research work presented in this thesis highlights the potential of hyaluronan- based hydrogels as versatile scaffolds. The work contributes significant insights into the development of next-generation biomaterials that leverage the multifunctional attributes of dopamine and gallol moiety, paving the way for advanced and reliable tissue engineering strategies. Overall, engineering such multifunctional hydrogels represents a transformative approach to the design of biomaterials, offering substantial improvements in biocompatibility, mechanical performance, and therapeutic efficacy.