Production of (RHAG)2(Rhce) protein complex displayed on HIV-1 VLP surface : Novel approach for antibody inhibition

Abstract

Background & Aims: The Human Rh blood group is the second most significant blood group after ABO. Antibodies against Rh antigens are capable of causing severe transfusion reactions but also hinder the identification of other blood group antibodies. The most problematic antigens in the Rh system are c and e antigens because of their high prevalence and antibodies against these antigens mask other significant antibodies. This study aims to produce a novel method for antibody inhibition for these specific antigens. Recombinant Rhce and RHAG proteins expressing e and c antigens are expressed on mammalian cells and displayed on the surface of the HIV-1 VLP particle in soluble form. Soluble Rh antigens are meant for inhibition of Rh blood group antibodies Anti-c and Anti-e present in the patient samples, furthermore, assisting detection and identification of other blood group antibodies. Successful inhibition of blood group antibodies will make blood transfusion safer, hastens the identification of other blood group antibodies and allows an earlier start of the required blood transfusion.

Methods: This thesis is a combination of literature review and qualitative research where desired recombinant protein complex (RHAG)2(Rhce) is produced and its ability to inhibit antibodies is studied. During the literature review blood group antibodies, and their inhibition is studied together with recombinant protein production and expression of the protein on the surface of VLP particles.

Results: Recombinant proteins RHCE and RHAG were successfully produced separately and together through transient expression in Expi293F cells, protein expression was confirmed through western blotting. Transient expression of HIV-1 VLPs was conducted alone in Expi293F cells and co-expressed together with RH-proteins. VLP expression was confirmed with western blotting and TEM imaging of the VLPs. The VLPs displaying RH-protein complexes' ability to inhibit corresponding antibodies was tested through routine antibody identification assay where results were inconclusive because only minimal inhibition was observed.

Conclusions: The displaying of blood group antigens on the surface of eVLPs offers an alternative and interesting way for antibody identification in routine blood banking applications. Results give rise to multiple problems to solve, including the high cost of antigen expression in mammalian cells, laborious workflow, and scalability of the method, among the challenges of VLP shelf-life and storage. Additional future testing is necessary to solve the challenges previously mentioned in antibody inhibition, but also other applications could be developed that utilize the protein presentation on the surface of VLPs.

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Ihmisen Rh-veriryhmäjärjestelmä on ABO-veriryhmäjärjestelmän jälkeen toiseksi merkityksellisin veriryhmäjärjestelmä. Vasta-aineet Rh-veriryhmäjärjestelmän antigeenejä kohtaan kykenevät aiheuttamaan vakavia verensiirtoreaktioita, mutta myös häiritsemään muiden veriryhmävasta-aineiden tunnistamista. Rh-veriryhmäjärjestelmään kuuluvat antigeenit e ja c ovat yleisyytensä takia ongelmallisia, koska vasta-aineet näitä antigeenejä kohtaan peittävät alleen muita merkityksellisiä vasta-aineita. Tutkimuksen tavoitteena on tuottaa rekombinantti proteiinikompleksi, jonka pinnalla esiintyvät Rh-antigeenit c ja e yhdessä RhAG proteiinin kanssa. Proteiinit on tarkoitus tuottaa ihmisperäisissä soluissa ja lopullisesti esitellä VLPpartikkelien pinnalla liukoisessa muodossa. Liukoisilla Rh-antigeeneillä pyritään inhiboimaan Anti-c ja Anti-e vasta-aineita potilasnäytteistä, joka helpottaa muiden veriryhmävasta-aineiden tunnistamista. Onnistunut vasta-aineiden inhibitio lisää verensiirtojen turvallisuutta, nopeuttaa muiden vasta-aineiden tunnistamista sekä mahdollistaa verensiirtojen nopeamman toteuttamisen.

Menetelmät: Tutkimus on yhdistelmä kokeellista tutkimusta, jonka puitteissa haluttu (RHAG)2(Rhce) rekombinantti proteiinikompleksi tuotetaan ja sen toimintaa inhibiittorina tutkitaan, sekä kirjallisuuskatsausta, jossa perehdytään veriryhmävasta-aineisiin, niiden inhibitioon, proteiinien tuottamiseen sekä proteiinien ekspressioon VLP-partikkelien pinnalla.

Tutkimustulokset: Rekombinantit proteiinit RHCE ja RHAG onnistuttiin tuottamaan yhdessä ja erikseen lyhytaikaisella ekspressiolla Expi293F soluissa. Proteiinien ekspressio varmistettiin western blot menetelmällä. Lyhytaikaisesti ekspressoitu HIV-1 VLP tuotettiin sekä yksinään, että yhdessä Rh proteiinien kanssa Expi293F soluissa. Viruksen kaltaisten partikkelien ekspressio varmistettiin western blot menetelmällä, sekä kuvantamalla partikkelit TEM-menetelmällä. Tuotettujen Rh proteiinikompleksien ja niitä kantavien viruksen kaltaisten partikkelien kykyä inhiboida vastaavia vasta-aineita tutkittiin rutiinin omaisilla vasta-aineiden tunnistusmenetelmillä. Tutkimukset jäivät epäselviksi johtuen vain minimaalisesta inhibitiossa, joka oli tutkimuksissa havaittavissa.

Johtopäätökset: Veriryhmä antigeenien ilmentäminen vaipallisten viruksen kaltaisten partikkelien pinnalla tarjoaa vaihtoehtoisen ja kiinnostavan tavan vasta-aineiden tunnistamiseen rutiininomaisten verikeskus menetelmien joukossa. Tulokset paljastavat myös paljon haasteita, jotka tulee ratkaista, kuten antigeenien ekspression eläinsoluissa ja koko prosessin korkea hinta, raskas työtaakka ja metodin skaalaus, yhdistettynä viruksen kaltaisten partikkelien säilytykseen ja varastointiin.