Heterogeneous volumetric crosslinking of Gellan Gum-based hydrogels

Abstract

For some time, hydrogel biomaterials have been of core interest in the field of tissue engi-neering. One of the main beneficial properties of hydrogels is the high tuneability of their mechanical properties via the modification of the degree of crosslinking (DOC) between their structural units, polymer chains. Increased crosslinking adds temporary non-covalent interactions or permanent covalent bonds between polymer chains, allowing the controlled stiffening of the gel matrix. A higher DOC matrix provides mechanical strength and shape fidelity, bearing some load, restricting random motion and guiding e.g. cell movement and growth within the matrix in a desired direction. Crosslinking applications range from rapid volumetric gelation of entire 3D constructs to intricate localized patterns inside hydrogel matrices.

Photocrosslinking is a covalent crosslinking approach which utilizes a chemical compound group called photoinitiators (PI). Photocrosslinking is a promising method for the spatially controlled change of DOC in hydrogels due to the detailed and versatile pattern properties of light. PIs absorb energy from photons of specific wavelength, producing radical reaction products which form permanent bonds between polymer chains, increasing the DOC. The efficiency of the PIs used in this research have been previously verified at non-toxic concentrations with photoactivity within the visible light wavelength range, giving them potential to be integrated in sensitive hydrogel approaches.

In this research, we planned to explore the potential application of inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) for the photopatterned crosslinking of methacrylated gellan gum (GGMA) hydrogels. Hydrogels are designed to undergo primary ionic crosslinking in the presence of calcium chloride and localized secondary crosslinking via visible light in the presence of a PI. The light sheet illumination used in iSPIM is hypothesized to form stripe-like stiffened regions within the softer, lower DOC matrix which it penetrates.

To evaluate this application, we used two PI systems – lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) and Eosin Y (EY). The photoactivation reaction of LAP is simpler and it has a lower photoactive range (365-420 nm) than EY (480-550 nm), which has a more sensitive photoactivation route. The two PIs were integrated in GGMA hydrogel precursors and irradiated by appropriate wavelength light sources. Primary, secondary and dual crosslinked samples were prepared in laboratory environments and gold nanoparticles (NP) and fluorophores were added for characterization. Different samples were examined with bright field microscopy and microrheology paired with fluorescence microscopy to determine changes in refractive index and rheological properties which stem from DOC variations.

This dual-crosslinking approach gave insight to the illumination and gel conditions required for the fabrication and detection of intricately confined crosslinked areas. Different crosslinking mechanisms were optimized and their differences and effects on the heterogeneity of the final hydrogel structure were examined. Obtained results show, that gels fabricated with certain material parameters are heterogeneously photocrosslinkable. The result is promising, because if this is feasible with the light parameters of iSPIM, simultaneous photocrosslinking and imaging of hydrogels is possible. Future developments include the expansion of the experimental part and acquiring more benchmark results on patterns caused by photocrosslinking. The use of the iSPIM setup for photocrosslinking requires better correspondence between the photoinitiator of choice and the wavelength of the excitation illumination.

Hydrogeelit ovat olleet jo jonkin aikaa mielenkiinnon kohde biomateriaaleina kudosteknologian alalla. Yksi tärkeimmistä hydrogeelien mahdollisuuksista on mekaanisten ominaisuuksien säädettävyys niiden rakenteellisten yksiköiden, polymeeriketjujen, välistä ristisilloittumisastetta muuttamalla. Lisääntynyt silloittuneisuus lisää tilapäisiä ei-kovalentteja vuorovaikutuksia tai pysyviä kovalenttisia sidoksia polymeeriketjujen välillä mahdollistaen geelimatriisin hallitun jäykistymisen. Korkeamman silloittumisasteen geelimatriisi tarjoaa enemmän mekaanista lujuutta ja pysyvämmän muodon rajoittaen satunnaista liikettä ja ohjaten mm. solujen kulkua ja kasvamista matriisin sisällä. Silloittamissovellukset vaihtelevat kokonaisten 3D-rakenteiden nopeasta volumetrisestä jähmettämisestä monimutkaisten lokalisoitujen kuvioiden muodostamiseen matriisin sisälle.

Valosilloittaminen on kovalenttinen silloittamismenetelmä, jossa hyödynnetään fotoinitiaattoreiksi kutsuttuja kemiallisia yhdisteitä. Valon yksityiskohtaisten ja monipuolisten kuvio-ominaisuuksien myötä valosilloittaminen on lupaava metodi hydrogeelien ristisilloitusasteen hallitulle alueelliselle muokkaamiselle. Fotoinitiaattorit absorboivat energiaa tietyn aallonpituuden fotoneista tuottaen reaktiotuotteina radikaaleja, jotka muodostavat pysyviä kemiallisia sidoksia polymeeriketjujen välille kasvattaen ristisilloitusastetta. Käytettyjen fotoinitiaattorien tehokkuus on todistettu aiemmin kirjallisuudessa soluystävällisissä pitoisuuksissa ja näkyvän valon aallonpituusalueella, mikä mahdollistaa niiden integroimisen herkkiinkin hydrogeelisovelluksiin.

Tutkimuksessa oli tavoitteena käänteisen selektiivisen tasovalaistusmikroskopian (iSPIM) arvioiminen mahdollisena sovelluksena metakryloidusta gellaanikumista valmistettujen hydrogeelien heterogeenisessa valosilloittumisessa. Tutkitut hydrogeelit on suunniteltu ristisilloittumaan ensin primaarisesti kalsiumkloridiliuoksen sisältämien ionien avulla ja sen jälkeen sekundaarisesti fotoinitiaattorien avulla, kun niitä valaistaan näkyvällä valolla. iSPIM:ssä käytetyn valotason oletetaan muodostavan raitamaisia jäykistettyjä alueita sen lävistämän pehmeämmän, vähemmän ristisilloittuneen matriisin sisällä.

Sovelluksen arviointiin käytettiin kahta fotoinitiaattoria – litiumfenyyli-2,4,6-trimetyylibentsoyylifosfinaattia (LAP) ja Eosin Y:tä. LAP:n fotoinitiaatioreaktio on yksinkertaisempi ja sillä on matalampi fotoaktiivinen aallonpituusalue (365-420 nm) kuin fotoinitiaatioltaan herkemmällä Eosin Y:llä (480-550 nm). Kumpaakin fotoinitiaattoria integroitiin metakryloidusta gellaanikumista valmistettuihin hydrogeelin esiasteisiin ja geelejä valaistiin sopivan aallonpituuden valonlähteillä. Primaari-, sekundaari- ja kaksoissilloitetut näytteet valmistettiin laboratorio-olosuhteissa ja niihin lisättiin kulta-nanopartikkeleja ja fluoroforeja karakterisointia varten. Eri näytteitä tutkittiin visuaalisesti optisella mikroskoopilla sekä mikroreologisesti fluoresenssimikroskoopin avulla ristisilloitusasteen vaihtelun aiheuttamien taitekertoimen ja reologisten ominaisuuksien muutosten määrittämiseksi.

Tämä kaksoisristisilloitus-lähestymistapa loi katsauksen siihen, millaiset olosuhteet vaaditaan tarkasti rajattujen silloitusalueiden muodostumiseen ja havaitsemiseen. Eri silloitusmekanismeja optimoitiin ja niiden väliset erot ja niiden heterogeeniset vaikutukset lopullisen hydrogeelin rakenteeseen olivat havaittavissa. Saadut tulokset osoittavat, että tietyillä materiaaliparametreillä valmistettua hydrogeelia on mahdollista valosilloittaa heterogeenisesti. Tulos on lupaava, sillä jos tämä on mahdollista iSPIM-menetelmän valoparametreillä, on mahdollista silloittaa ja kuvantaa hydrogeelinäytteitä samanaikaisesti. Tulevaisuutta ajatellen kokeellista osuutta on laajennettava ja valosilloittuneille kuvioille on luotava enemmän pohjatuloksia. iSPIM-systeemin käyttö valosilloittamiseen vaatii fotoinitiaattorin ja valon aallonpituuden tarkempaa vastaavuutta.