Developing Clinically Compatible Bioinks and Novel Multi-material 3D Bioprinting Strategies : Applications in Human Stem Cell Based Cornea

Abstract

Maailmanlaajuinen puute siirrettävistä kudoksista ja elimistä on merkittävä syy sille, miksi uudenlaisia biovalmistusmenetelmiä tarvitaan. Kolmiulotteinen (3D) biotulostus on lupaava teknologia regeneratiivisessa lääketieteessä, sillä se mahdollistaa kudosten tarkan, automaattisen ja skaalattavan valmistuksen. Sen kliinistä käyttöönottoa rajoittaa kuitenkin eläinperäisten ja biohajoamattomien biomateriaalien sekä luovuttaja-riippuvaisten solujen käyttö, minkä vuoksi kliinisesti yhteensopivien raaka-aineiden ja solujen kehitys on välttämätöntä. Monimateriaalibiotulostus vie teknologiaa eteenpäin yhdistämällä erilaisia biomateriaaleja ja solutyyppejä yhteen rakenteeseen, siirtäen yksinkertaisten rakenteiden biotulostuksen kohti monimutkaisempia, biomimeettisiä kudoksia.

Ihmisen sarveiskalvo on yksi niistä kudoksista, joissa on vakava puute luovutetuista kudossiirteistä. Sarveiskalvosiirteiden biotulostus tarjoaa tähän puutteeseen lupaavan ratkaisun, mahdollistaen potilaiden elämänlaadun parantamisen. Verrattuna perinteisiin kudosteknologian menetelmiin, monimateriaalibiotulostus mahdollistaa sarveiskalvon kerrosten sekä monimutkaisen mikrorakenteen merkittävästi tarkemman jäljittelyn. Lisäksi ihmisen rasvakudoksen kantasoluilla (eng. human adipose tissue -derived stem cells, hASC) ja uudelleen ohjelmoiduilla erittäin monikykyisillä indusoiduilla kantasoluilla (engl. human induced pluripotent stem cells, hiPSC) on valtava potentiaali sarveiskalvon kudosteknologiassa, sillä ne tarjoavat kliiniseen käyttöön soveltuvat ja skaalattavat solulähteet. Kaiken kaikkiaan, biomimeettisten sarveiskalvorakenteiden tuotanto vaatii toiminnallisten solujen erilaistamisen, solutyyppispesifisten biomusteiden kehittämisen sekä kudosmuodostusta ja siirteen integroitumista tukevan 3D- ympäristön luomisen.

Tämä väitöskirja tutki kliinisesti soveltuvien biomusteiden sekä monimateriaali- biotulostusstrategioiden kehittämistä biomimeettisten sarveiskalvorakenteiden tuottamiseen, sekä näiden rakenteiden siirtostrategioita sian sarveiskalvon ex vivo- mallissa. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä kehitettiin uudenlainen sarveiskalvo- spesifinen biomuste ilman tarvetta luovutettuihin sarveiskalvoihin hyödyntämällä soluväliainetta, joita hASC-solut tuottivat erilaistuessaan kohti sarveiskalvon strooman keratosyyttejä (engl. hASC-derived corneal stromal keratocytes, hASC-CSK). Toisessa osatyössä kehitettiin monimateriaalibiotulostusstrategia sarveiskalvon stroomakerroksen mikrorakenteen jäljittelemiseksi kahdella erilaisella biomusteella sekä hASC-soluilla. Tämä lähestymistapa mahdollisti solujen kasvun pehmeämmässä biomusteessa, kun jäykempi soluton biomuste tarjosi mekaanista kestävyyttä sekä kasvun ohjausta soluille. Kolmannessa osatyössä tätä lähestymistapaa hyödynnettiin strooma- ja epiteelikerrosten integroimiseen yhdistämällä aiemmin kehitetty stroomakerroksen mikrorakenne ja hASC-CSK-solut sekä hiPSC-soluista erilaistetut limbaaliset kantasolut (engl. hiPSC-derived limbal stem cells, hiPSC-LSC).

Kaiken kaikkiaan tämä väitöskirja esittelee uudenlaisia, kustannustehokkaita sekä kliinisesti toteuttamiskelpoisia ratkaisuja 3D-biotulostuksen edistämiseksi kohti kliinistä käyttöä. Väitöskirjassa esitellyt tulokset tuovat tärkeää tietoa monimutkaisempien ja biologisesti relevantimpien kudoskorvikkeiden valmistuksesta kliinisesti yhteensopivista raaka-aineista ja soluista. Nämä edistysaskeleet ovat keskeisiä biotulostuksen kliiniselle käyttöönotolle erityisesti silloin, kun luovutettujen kudossiirteiden saatavuus on rajattu.

The scarcity of tissues and organs needed for transplantations is a major reason why innovative biofabrication technologies are needed. Three-dimensional (3D) bioprinting is an additive manufacturing technology with the potential to revolutionize regenerative medicine by offering precision, automation and scalability. However, reliance on animal-derived and non-biodegradable biomaterials and donor-dependent primary cells is a major bottleneck hindering its clinical translation, highlighting the need for clinically compatible raw materials and cells. Furthermore, multi-material 3D bioprinting advances the current state-of-the-art by incorporating various biomaterials and cell types into one structure, shifting the paradigm of bioprinting from simple structures toward complex, biomimetic tissues.

Human cornea is one of the tissues where donor tissue shortage is severe. Hence, bioprinting corneal substitutes offers a promising solution to the scarcity of corneal transplants used for treating corneal blindness, with the potential of improving the lives of countless patients. Multi-material bioprinting surpasses the traditional tissue engineering (TE) methods in mimicking the multi-layer nature of the cornea as well as its complex microstructure. Moreover, human adipose tissue-derived stem cells (hASCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have shown tremendous potential in corneal TE, providing a clinically relevant and scalable cell sources. Overall, producing fully biomimetic corneal equivalents requires differentiating functional cells, designing bioinks to fulfill the cell type-specific requirements, and creating a 3D environment to support tissue maturation and integration after transplantation.

This dissertation explored the development of clinically relevant bioinks and multi-material bioprinting strategies to create biomimetic corneal structures, as well as transplantation strategies for these bioprinted structures using a porcine cornea ex vivo model. First, a novel cornea-specific bioink was developed without relying on donor corneas, leveraging the extracellular matrix (ECM) produced during the differentiation of hASCs toward corneal stromal keratocytes (hASC-CSKs). Second, a multi-material bioprinting strategy was designed to mimic the microstructure of corneal stroma by using two different bioinks and hASCs. This approach enabled cellular growth in the softer bioink, while the acellular stiffer bioink provided mechanical strength and guidance for the cells. Third, this multi-material strategy was employed to integrate the stromal and epithelial layers by combining the previously developed stromal microstructure and hASC-CSKs with hiPSC-derived limbal epithelial cells (hiPSC-LSCs) for the epithelium.

To conclude, this dissertation presents innovative, streamlined, and most importantly, clinically applicable approaches to advance 3D bioprinting toward clinical use. The results from this thesis provide important insight into producing tissue substitutes with greater complexity and biological relevance by utilizing clinically compatible raw materials and cells. Furthermore, these results contribute to the scientific advancements essential for clinical translation of bioprinting, particularly when the availability of donor tissues is limited.