From Neoplastic Cells to Non-Canonical Immune Subsets in Human Brain Tumors

Abstract

Aivoihin metastasoituneille ja primääreille aivokasvaimille on tyypillistä immunologisesti vaimentava kasvainmikroympäristö, johon kuuluu kasvain-, immuuni-, hermo- ja muita stroomasoluja. Aikuisten diffuusit glioomat, jotka ovat primaarisista pahanlaatuisista aivokasvaimista yleisimpiä, voidaan jakaa kahteen pääluokkaan: isositraattidehydrogenaasi-villityyppeihin (IDH^WT) ja IDH- mutantteihin (IDH^mut). IDH^mut-kasvaimissa kromosomaalisen 1p/19q-ko-deleetion diagnostinen testaus on äskettäin laajennettu sisältämään CDKN2A/B- homotsygoottisen deleetion määrityksen mahdollistaen potilaan tarkemmat diagnoosi- ja ennuste-arvioit. Tiedetään, että kasvaimiin tunkeutuvat ja niitä tuhoavat sytotoksiset solut ovat heikosti aktivoituneita tai uupuneessa tilassa, näiden solujen alatyyppien syvällisempi tuntemus on vajavaista. Kasvainten immunologisen mikroympäristön vaikutusta aivokasvaimissa ja niiden sisältämiä immuunisolujen alatyyppejä on ei täysin tunneta. Tämä puolestaan rajoittaa mahdollisuuksia löytää uusia mikroympäristöön kohdistuvia tai sitä hyödyntäviä hoitomuotoja.

Tämän väitöskirjan tavoitteena on tutkia tarkemmin aivokasvainten immunologisia ja neoplastisia komponenttejä. Ensin soveltaan datalähtöisiä laskennallisia lähestymistapoja määrittämään kasvainmiksoympäristön rakennetta joko transkriptomin avulla tai yhdistettynä virtaussytometriseen immunofenotyypitykseen. Laskennalliset klusterointi- ja dekonvoluutiomenetelmät luokittelivat primaariset aivojen TiME:t kahdeksan immuunijärjestelmään geeniklusterin perusteella. Nämä klusterit paljastivat kolme yleistä TiME-profiilia: negatiivisen, humoraalisen ja soluvälitteisen. Lisäksi käyttämällä vasta-ainepaneelia, joka analysoi samanaikaisesti eri pääleukosyyttipopulaatioita, alkuperäiset aivokasvaimen TiME:t selvitettiin puolueettomalla klusteroinnilla virtaussytometriadatasta. Lopputuloksena oli ensimmäinen julkaistu todiste epätyypillisistä myeloidisista soluista aivokasvaimissa: CD3⁺ myeloidisoluista ja CD19⁺ myeloidisoluista. Lisäksi paljastui populaatioita, joihin kuului epätyypillisiä kaksoisnegatiivisia T-soluja (CD3+CD4-CD8^-) ja kaksoispositiivisia T-soluja (CD3⁺CD4⁺CD8⁺). Ensin mainitut, γδ⁺ T-soluihin viittaavat solut määritettiin käyttämällä ulkoista massasytometria-datasettiä. Jälkimmäinen fenotyyppi edusti todennäköisesti uupuneita T-solualatyyppejä. Havainto CD3⁺ myeloidisoluista vahvistettiin ulkoisessa yksisolu-RNA-sekvensointidatasetissä sekä omassa validointikohortissamme.

Seuraavaksi, kehittämiämme kokeellisia potilasperäisiä aivokasvainmalleja käytettiin kahdella tavalla: kasvainten lisäluokitteluteknologian validointiin sekä kehitettiin tuumorikudosta diagnosoivaa uutta tunnistusteknologiaa, ja syöpäkantasolujen signalointia. Differentiaalimobiliteettispektrometriaa (DMS) käytettiin <i>ex vivo</i> potilasperäisissä glioma-oragnoideissa, joka erotteli IDHWT-tyyppiset organoidit IDHmut-tyyppisistä yli 90 %:n tarkkuudella käyttäen lineaariseen diskriminanttianalyysiin perustuvaa luokittelualgoritmia. Lisäksi epätyypilliset Wnt (non-canonical Wnt, NCW) -reittireseptorit katsottiin sopiviksi kandidaateiksi syöpäkantasoluihin kohdennetuille interventioille, tutkimustuloksina oli heterogeenisiä riippuvuuksia ja vasteita NCW-reseptorien ROR1, ROR2 tai PTK7 hiljentämiseen kaupallisissa (LN229, SNB19 ja U118MG) glioblastoomasolulinjoissa. Lääkeaineiden seulonnat, jotka suoritettiin kaupallisilla (LN229, U118MG) ja potilasperäisillä aivokasvainmalleilla, viittasivat mahdolliseen synergiaan HDAC-inhibiittoreiden ja NCW-reittiin kohdistuvien interventioiden välillä.

Tämä väitöskirja, tämä väitöskirja korostaa potilasperäisen materiaalin käyttöä ja <i>ex vivo</i> -mallien tarjoamia laajoja mahdollisuuksia. Väitöskirjan tulokset korostavat <i>ex vivo</i> mallien hyödyllisyyttä aivokasvaimien immunologisen mikroympäristön, kasvainten luokitteluteknologioiden, sekä mahdollisten lääkkeellisten interventioiden tutkimuksessa.

Primary and metastatic brain tumors are characterized by tumor microenvironments of a suppressive nature that include tumor, immune, neural and other stromal cells. Adult diffuse gliomas, one type of primary brain tumors, can be largely grouped between two classes, isocitrate hydrogenase wild type (IDH^WT) or IDH mutant (IDH^mut). Within IDH^mut tumors, the diagnostic testing of 1p/19q co- deletion status has been recently expanded to include the assessment of CDKN2A/B homozygous deletion, improving the diagnosis and prognosis estimates. Though there is evidence that infiltrating anti-tumor cytotoxic cells are deficiently activated or in an exhausted state, deeper knowledge of infiltrating and resident leukocyte subsets is missing. Subsequently, how the tumor immune microenvironments (TiME) are configured across brain tumors and whether they include immune subsets beyond the traditional are not known. This, in turn, limits the chance of novel TiME intervention discoveries.

Accordingly, the dissertation herein aimed to further explore the immune and neoplastic brain tumor compartments. Firstly, it aimed to apply data-driven computational approaches to resolve TiMEs from either transcriptomic data alone or in combination with flow cytometry (FCM)-based immunophenotyping. Computational clustering and deconvolution methods were used to organize primary brain TiMEs on the basis of eight immune system-related gene clusters. These clusters revealed three overall TiME profiles: the Negative, the Humoral and Cellular-like TiME subgroups. Moreover, based on an antibody panel that addressed all of the main leukocyte populations simultaneously, native state brain tumor TiMEs were resolved using unsupervised clustering on FCM data. This led to the first reported evidence of noncanonical myeloids in brain tumors, which consisted of CD3⁺ myeloids and CD19⁺ myeloids. Furthermore, the analysis of FCM data uncovered atypical populations of immune cells including double negative T (DNTs) cells (CD3⁺CD4^-CD8sup>-</sup>) and double positive T (DPTs) cells (CD3⁺CD4⁺CD8⁺). The former, indicative of γδ⁺ T cells, was resolved by using the cytometry by time of flight (CyTOF) external dataset. The latter phenotype likely represented exhausted T lymphocyte subsets. The evidence of CD3⁺ myeloids was confirmed with an external single-cell RNA sequencing (SCS) compiled dataset, in addition to our in-house validation cohort.

Secondly, in-house experimental patient-derived brain tumor models (PDMs) were applied in this thesis in a twofold manner: to validate adjuvant tumor classification technology; and to examine cancer stem-like cell (CSCs) signaling dependencies. Differential mobility spectrometry (DMS) was used on <i>ex vivo</i> patient-derived glioma organoids (PGOs), which sorted IDHWT from IDHmut PGOs with over 90% classification accuracy (CA) using a classification algorithm based on linear discriminant analysis. In addition, the non-canonical Wnt (NCW) pathway receptors, recently considered suitable candidates for CSC targeted interventions, revealed upon knock-down heterogeneous dependencies and responses to NCW receptors ROR1, ROR2 or PTK7 silencing on commercial (LN229, SNB19 and U118MG) glioblastoma cell lines. Furthermore, drug screenings were performed on commercial cell lines (LN229, U118MG) and PDMs, the results of which suggested potential synergy between HDAC inhibitors and NCW pathway intervention.

In summary, the dissertation herein highlights the use of patient-derived material and the broad opportunities that <i>ex vivo</i> models provide. Ranging from brain TiME elucidation to the testing of tumor classification technologies and niche vulnerabilities, this work denotes collectively the relevance of <i>ex vivo</i> models in brain tumor research.