Human Pluripotent Stem Cell-Derived Corneal Endothelial Cells as a Potential Treatment for Corneal Blindness

Abstract

Sarveiskalvo on silmän uloin osa. Se muodostaa silmään kirkkaan ikkunan, joka mahdollistaa näkökyvyn ohjaamalla valoa verkkokalvolle samalla suojaten silmän sisäosia. Sarveiskalvon takapinnan solukerros, endoteeli, on yksikerroksinen solumatto, joka koostuu sarveiskalvon endoteelisoluista (engl. corneal endothelial cells, CEnC). Niiden tärkein tehtävä on pitää yllä sarveiskalvon nestetasapainoa pumppaamalla ylimääräistä nestettä pois sarveiskalvon keskiosasta, stroomasta.

Jos CEnC:t vahingoittuvat sairauden tai vamman johdosta, nestetasapaino järkkyy ja sarveiskalvoon vuotaa nestettä silmän etukammiosta, aiheuttaen kivuliasta sarveiskalvon turvotusta, joka heikentää merkittävästi näkökykyä. Lisäksi CEnC:t vähenevät iän myötä kaikilla, eivätkä ne uusiudu kuten useimmat muut kudokset. Toistaiseksi ainoa hoitomuoto endoteelikerroksen rappeumille on sarveiskalvon, tai sen osien, siirto kuolleelta luovuttajalta. Maailmanlaajuisesti tarkasteltuna sarveiskalvosiirrettä odottavia potilaita on yli kolmekymmenkertaisesti luovuttajiin nähden, joten tarve vaihtoehtoisille luovuttajista vapaille hoitomuodoille ja solulähteille on suuri. Edesmenneet luovuttajat ovat usein vanhoja ihmisiä, joilla siirrännäisinä saatujen endoteelisolujen määrä on jo valmiiksi alentunut, ja lisäksi siirteet säilyvät käyttökelpoisina kudospankeissa vain noin kuukauden.

Kantasolujen kyky uusiutua ja muodostaa uusia kudoksia tarjoaa potentiaalisen ratkaisun luovuttajapulaan. Tässä väitöskirjassa kehitetty menetelmä erilaistaa ihmisen monikykyisistä kantasoluista (engl. human pluripotent stem cells, hPSC) CEnC:ja, jotka voisivat potentiaalisesti tulevaisuudessa tarjota silmälääkäreille käyttöön uuden työkalun hoitaa sarveiskalvosokeuksia. Lisäksi hPSC:ja olisi mahdollista tuottaa uudelleen ohjelmoimalla potilaan omia verisoluja, jolloin vältyttäisiin immuunijärjestelmän hylkimisreaktioilta. Kehitetty erilaistusmenetelmä perustuu hPSC:jen soluviljelyn yhteydessä käytettyjen pienmolekyylisten induktioaineiden, transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β) inhibiittorin ja glykogeenisyntaasikinaasi-3 (GSK-3) inhibiittorin toimintaan yhdessä retinolihapon (RA) kanssa. Lisäksi samalla erilaistusmenetelmällä tuotettiin sarveiskalvon keratosyyttejä (engl. corneal keratocytes, CK), joita saatiin puhdistettua soluviljelmästä muokkaamalla viljelyolosuhteita. Myös hPSC-CEnC:ja puhdistettiin köyhdyttämällä soluviljelyn kasvuympäristöä. Väitöskirjassa tutkittiin myös tuotettujen hPSC-CEnC:jen soveltuvuutta 3D-biotulostuksessa. Solujen käyttämistä biomusteessa testattiin laajasti <i>ex vivo</i> -menetelmillä sekä hPSC-CEnC:ja biotulostettiin onnistuneesti tiettävästi ensimmäistä kertaa maailmassa. Tutkimuksen tärkeimpinä käytettyinä analyysimenetelminä toimivat mikroskopia, immunofluoresenssikuvaus ja qPCR.

Tässä väitöskirjassa tuotettu uudenlainen erilaistusmenetelmä on huomattavasti nopeampi ja yksinkertaisempi verrattuna aiemmin tunnettuihin menetelmiin. Lisäksi tuotetulla erilaistusmenetelmällä voidaan erilaistaa myös sarveiskalvon CK:n kaltaisia soluja. Onnistuneesti biotulostetut hPSC-CEnC:t mahdollistavat tulevaisuudessa kokonaisen 3D-biotulostetun sarveiskalvon rakentamisen.

The cornea is the outermost part of the eye, serving to protect the interior eye and facilitate clear vision by refracting light through its transparent window onto the retina. The innermost layer of the cornea, known as the corneal endothelium, consists of a single layer of specialized cells called corneal endothelial cells (CEnCs). The primary function of CEnCs is to preserve the transparency of the cornea by maintaining its relative dehydration.

When CEnCs are damaged by dystrophy or trauma, they can no longer prevent fluid from entering the corneal stroma, leading to painful swelling of the cornea and resulting in visual impairment. Additionally, the number of CEnCs gradually decreases with age. Since CEnCs cannot regenerate in vivo like most other cell types in the body, they are crucial for preserving vision. Currently, cadaveric donor corneal transplantation (whether full-thickness or partial) is the only available treatment for CEnC dysfunction. Unfortunately, it is estimated that there is only one donor for every 30 patients worldwide, highlighting the urgent need for donor-free treatments and alternative cell sources. Additionally, many donors are often elderly, resulting in a lower density of CEnCs. Furthermore, corneal transplants in tissue banks remain viable for only up to one month after being removed from the donor eye.

Human pluripotent stem cells (hPSC) are self-renewing cells, along with the potential to differentiate into almost any tissue of the body. Thus, hPSCs were used in this dissertation to develop methods for producing CEnCs, which could offer a new tool for ophthalmologists to treat patients in the future. Additionally, hPSC- CEnCs can be generated from patients' own cells by reprogramming blood cells, thereby preventing adverse immune responses. The developed differentiation protocol is based on small-molecule induction using transforming growth factor beta (TGF-β) and glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) inhibition together with retinoic acid (RA). Furthermore, hPSC-CEnCs were purified through metabolic starvation. The developed differentiation protocol produced also corneal keratocytes (CK), which were further enriched by modifying the cell culture. To expand the potential applications of hPSC-CEnCs, this dissertation focused on testing an appropriate bioink for 3D bioprinting. An optimized bioink was designed, and its biocompatibility with hPSC-CEnCs was evaluated through <i>ex vivo</i> assays.

Furthermore, this work led to the successful 3D bioprinting of hPSC-CEnCs, a first in the field. The majority of the characterizations and analyses were conducted with microscopy, immunofluorescence, and qPCR methods.

The novel hPSC-CEnC differentiation method developed in this dissertation is considerably faster and simpler than other known protocols. The differentiation protocol also produces hPSC-CK-like cells and both cell types can be enriched. Furthermore, bioprinting of hPSC-CEnCs potentially enables construction of a 3D bioprinted full-thickness cornea for future clinical applications.