In Vitro Neuron-Astrocyte Networks and Their Modulation on Microelectrode Arrays

Abstract

Aivot koostuvat hermokudoksesta, joka sisältää useita eri solutyyppejä. Yhdessä aivot ja selkäydin muodostavat keskushermoston, joka säätelee kehon tahdonalaisia ja tahdosta riippumattomia toimintoja. Yksi keskushermoston solutyypeistä ovat hermosolut eli neuronit, jotka ovat sähköisesti aktiivinen soluja, jotka vastaavat tiedon siirtämisestä sähkökemiallisten signaalien eli aktiopotentiaalien avulla. Neuronit muodostavat laajoja verkostoja, jotka ovat rakenteeltaan ja toiminnaltaan monimutkaisia ja dynaamisia. Nämä hermoverkostot kietoutuvat yhteen astrosyyttiverkostojen kanssa.

Astrosyytit ovat keskushermoston hermotukisoluja, ja ovat yksi aivojen yleisimmistä solutyypeistä. Astrosyytit ovat välttämättömiä hermosolujen toiminnan ja aivojen homeostaasin ylläpitämiseksi, sillä ne säätelevät synaptista tiedonvälitystä osallistumalla gamma-aminovoihappo- (GABA-) ja glutamaattivälitteisiin signalointireitteihin, jotka vähentävät tai lisäävät hermosolujen sähköistä aktiivisuutta. Kriittisestä roolistaan huolimatta astrosyyttien merkitystä <i>in vitro</i> laboratoriomalleissa, erityisesti koskien neuronien ja astrosyyttien suhteellisia määriä ja astrosyyttien vaikutuksia erilaisiin viljelymalleihin, ei yleensä oteta riittävästi huomioon.

Tässä väitöskirjatyössä tavoitteena oli selvittää neuronien ja astrosyyttien välistä vuorovaikutusta käyttämällä erilaisia modulointimekanismeja: kemiallisia yhdisteitä ja sähköistä stimulaatiota <i>in vitro</i>. Työssä tutkittiin, kuinka astrosyyttien vuorovaikutus hermosolujen kanssa vaikuttaa hermoverkoston morfologiaan, kytkeytyneisyyteen ja elinkykyyn, ja erityisesti sähköfysiologisiin ja biokemiallisiin vasteisiin. Työssä käytettiin perinteisiä hermosoluviljelmiä sekä ohjattuja hermoverkostoja hyödyntäen hermosolujen aksonien kasvua suuntaavia mikrotunneleita mikroelektrodimatriisialustalla (MEA). Modulointimenetelmiin kuuluivat kemialliset yhdisteet, kuten gabatsiini, GABA-tyypin A reseptorin salpaaja, sekä yleisesti käytetty anestesialääke ketamiini. Lisäksi tutkimuksissa käytettiin uutta sähkövirran stimulaatiomuotoa nimeltään ajallinen interferenssistimulaatio (TIS), jota on aiemmin tutkittu vain vähän laboratoriomalleilla.

Tutkimuksen tulokset osoittivat, että astrosyytit parantavat hermosolujen morfologiaa ja kytkeytyneisyyttä <i>in vitro</i>. Astrosyytit moduloivat myös hermosolujen sähköfysiologista aktiivisuutta, jota arvioitiin mittaamalla hermosolujen sähköimpulssien määrää ja niiden samanaikaisuutta. Kaiken kaikkiaan, astrosyytit vaikuttivat hermosolujen sähköiseen ja biokemialliseen vasteeseen jokaisessa arvioidussa aikapisteessä. Tutkimuksessa havaitut erityiset biokemialliset vasteet vaihtelivat käytetystä kemiallisesta yhdisteestä riippuen, vaikuttaen erityisesti aivoperäisen hermokasvutekijän ja sen reseptoriin liittyvään signalointireittiin. Lisäksi tutkimustulokset osoittivat merkittäviä eroja perinteisen korkea- ja matalataajuusstimulaation ja TIS välillä hermosolujen sähköisessä aktiivisuudessa. Astrosyyttien havaittiin myös moduloivan hermosolujen sähköistä vastetta TIS:ään, mikä tarjoaa uutta tietoa hermosolujen sähköfysiologisesta toiminnasta TIS jälkeen. Tässä väitöskirjatutkimuksessa saadut tulokset korostavat astrosyyttien keskeistä roolia hermosolujen sähköfysiologisen aktiivisuuden ja biokemiallisen signaloinnin säätelyssä. Muutoksilla hermosolujen eksitatorisessa/inhibitorisessa tasapainossa on vaikutuksia hermoverkostojen toimintaan, mikä voi myötävaikuttaa erilaisten aivosairauksien, kuten epilepsian, patofysiologiaan. Tulokset tarjoavat uutta tietoa neuronien ja astrosyyttien monimutkaisista vuorovaikutuksista, korostaen astrosyyttien vaikutuksen huomioon ottamisen tärkeyttä ja mahdollisesti TIS:n käyttökelpoisuutta sekä perustutkimuksessa että terapeuttisissa tarkoituksissa.

The brain comprises nervous tissue that incorporates multiple cell types. The brain and spinal cord comprise the central nervous system (CNS) that controls the body’s voluntary and involuntary functions. Neurons are electrically active, excitable cell types in the CNS responsible for transferring information via electrochemical signal pulses called action potentials. Neurons form extensive networks that are complex and dynamic in their structure and function. Moreover, these networks are intertwined with astrocyte networks. Astrocytes, a type of glial cell, are among the most abundant cells in the brain.

Astrocytes are essential for maintaining neuronal function and brain homeostasis, as they actively regulate synaptic transmission by participating in gamma-aminobutyric acid (GABA) and glutamate-mediated signaling pathways that regulate neuronal inhibition and excitation, respectively. However, despite their critical role, the contributions of astrocytes in laboratory <i>in vitro</i> models have been usually overlooked, particularly considering the relative abundance of neurons and astrocytes and the impacts of astrocytes in various culture models.

This thesis aimed to highlight the intriguing interplay between neurons and astrocytes <i>in vitro</i> utilizing two modulatory mechanisms: chemical compounds and electrical stimulation. Thus, astrocytic influence on neuronal network morphology, connectivity, viability, and, more specifically, electrophysiological and biochemical responses were investigated. Cell culture models utilized were conventional dissociated cultures and engineered neural networks with novel axon growth- directive microtunnels on microelectrode arrays (MEAs). The modulatory methods included chemical compounds such as gabazine, a GABA type A receptor blocker, and ketamine, a commonly used anesthetic drug, as well as a new form of electrical current stimulation called temporal interference stimulation (TIS), previously less studied <i>in vitro</i>.

The results presented in this thesis showed that astrocytes enhanced neuronal morphology and network connectivity <i>in vitro</i>. Astrocytes modulated the electrophysiological activity of the neurons, as assessed by evaluating neuronal firing rates and network connectivity with MEAs. Overall, astrocytes shaped neuronal electrophysiological and biochemical responses at every assessed time point. Distinct biochemical responses, which varied depending on the chemical compound used, were observed to especially affect the brain-derived neurotrophic factor and its receptor tropomyosin receptor kinase B signaling pathway. In addition to pharmacological agents, significant differences existed in neuronal firing rates between traditional high/low-frequency stimulation and TIS. Astrocytes were found to modulate neuronal responses to TIS, which provided new insights into the effects of TIS on neuronal electrophysiological activity.

The findings of this thesis emphasize the vital role of astrocytes in regulating neuronal electrophysiological activity and biochemical signaling. Alterations in the neuronal excitatory/inhibitory balance have implications for neuronal network functionality that can contribute to the pathophysiology of various brain disorders, including epilepsy. This thesis highlights the importance of considering astrocytic influence and TIS’s applicability in basic research and therapeutic interventions by providing a deeper understanding of the complex dynamic interactions between neurons and astrocytes.