Laboratory Diagnostics of Tuberculosis and Nontuberculous Mycobacterial Infections : A Constant Shift Towards Molecular Methods

Abstract

<i>Mycobacterium tuberculosis</i> -bakteeri (Mtb) aiheuttaa tuberkuloosia (TB), joka on eräs globaalisti merkittävimmistä infektiotaudeista. Siinä missä tuberkuloosin esiintyvyys on laskenut tasaisesti, ei-tuberkuloottisten eli ympäristömykobakteerien (<i>nontuberculous mycobacteria</i>, NTM) aiheuttamat infektiot ovat vastaavasti lisääntyneet, ja saattavat paikallisesti ylittää tuberkuloosiesiintyvyyden. NTM:t voivat aiheuttaa tuberkuloosia kliinisesti muistuttavan kroonisen keuhkotaudin. Nämä ympäristössä esiintyvät opportunistibakteerit aiheuttavat merkittävää sairastavuutta ympäri maailman erityisesti iäkkäillä ja immuunipuutteisilla.

Tuberkuloosin laboratoriodiagnostiikka perustuu tyypillisesti värjäykseen ja viljelyyn. Värjäys on nopea, mutta epäherkkä menetelmä. Viljely sitä vastoin on Mtb- osoituksen referenssimenetelmä, mutta määritys kestää useita viikkoja. Näillä menetelmillä voidaan havaita haponkestäviä sauvoja, mutta ne eivät erittele Mtb ja NTM-bakteereita. Vuodesta 2010 alkaen Maailman terveysjärjestö (<i>World Health Organization</i>, WHO) on suosittanut nopeita molekyylidiagnostisia (MDx) testejä Mtb:n osoittamiseksi kliinisissä näytteissä. WHO:n <i>End TB</i> -strategian tavoitteiden mukaisesti tämän väitöskirjatutkimuksen tarkoituksena oli arvioida erilaisia kaupallisia MDx-menetelmiä tuberkuloosin laboratoriodiagnostisen prosessin kehittämiseksi. Tutkimuksen kohdeympäristönä on erityisesti Suomi, jonka tunnuspiirteitä ovat matala tuberkuloosi-ilmaantuvuus ja pieni väestö. Suomessa tuberkuloosin laboratoriodiagnostiikassa huomioidaan yleisesti myös NTM- löydökset, minkä vuoksi tutkimuksessa katettiin myös NTM-löydösten kokonaisuus. Tutkimuksessa arvioitiin yhteensä yhdeksää eri kaupallista MDx-menetelmää.

Viittä menetelmää arvioitiin sen suhteen, voitaisiinko näillä testeillä korvata vakiintunut Xpert MTB/RIF Ultra -testi (Cepheid; RIF: rifampisiini) Mtb:n ja sen rifampisiiniherkkyyden osoittamisessa. Näitä menetelmiä olivat Abbott RealTime MTB (Abbott Molecular) ja Abbott RealTi<i>m</i>e MTB RIF/INH Resistance (Abbott Molecular; INH: isoniatsidi), Anyplex II MTB/MDR (Seegene; MDR: moniresistentti), Allplex MTB/MDRe (Seegene) ja STANDARD M10 MDR-TB (SD BIOSENSOR). Anyplex MTB/NTMe (Seegene) ja STANDARD M10 MTB/NTM (SD BIOSENSOR) -testit havaitsevat ja erottelevat Mtb- ja NTM- löydökset. Näitä testejä arvioitiin niiden potentiaalin suhteen mykobakteeridiagnostiikan seulontamenetelmänä. FluoroType Mycobacteria (Hain Lifescience) -testiä arvioitiin sen suhteen, voitaisiinko testillä korvata manuaalinen GenoType Mycobacterium CM (Hain Lifescience) -testi viljelmistä tehtävässä mykobakteerien lajitunnistuksessa.

Yksikään arvioiduista menetelmistä ei ollut käytettävyydeltään optimaalinen tutkimusympäristössä. RealTi<i>m</i>e ja M10 -menetelmien suorituskyky Mtb:n suhteen oli hyvä ja rifampisiinin ja isoniatsidin pikaherkkyyden suhteen erinomainen – RealTi<i>m</i>e-menetelmä osoitti kuitenkin puutteita skaalautuvuudessa matalaan näytemäärään, kun taas M10 -menetelmään liittyi työturvallisuusriski heikon inaktivaatiotehon vuoksi. Seegenen testien suorituskyky sitä vastoin oli puutteellinen sekä Mtb- että NTM-detektion suhteen. Mykobakteerien seulonnassa ainoastaan M10 MTB/NTM osoitti riittävää suorituskykyä värjäyksen, mutta ei viljelyn korvaamiseen. Seulonta MTB/NTM-testillä voisi olla erityisen hyödyllistä paikoissa, joissa diagnostiikka perustuu vain Mtb:n detektioon. FluoroType Mycobacteria -testi osoitti merkittäviä etuja GenoType-prosessiin nähden, mutta samalla yllättävän heikkoa suorituskykyä kahden yleisimpiin kuuluvien, M.<i> intracellulare</i> ja M. <i>gordonae</i> - NTM-lajien tunnistukseen liittyen.

Tutkimuksessa voitiin osoittaa joitain olennaisen tärkeitä mykobakteerien nopean molekyylidiagnostiikan tekijöitä matalan tuberkuloosi-ilmaantuvuuden ja pienen väestön ympäristössä. Näitä ovat korkea kliininen suorituskyky ja erityisesti Mtb:n suhteen 100 % tarkkuus värjäyspositiivisten näytteiden kohdalla, prosessin kontrolloitavuus, skaalautuvuus pieneen tai kohtalaiseen näytemäärään ja työturvallisuutta edistävä, bakteerit inaktivoiva esikäsittelyvaihe. NTM-löydösten osalta suorituskykyä tulisi arvioida suhteessa lajien paikalliseen esiintyvyyteen ja kliiniseen tautiin. Tutkimustulosten perusteella on tarve edelleen kehittää kliiniseen tarpeeseen paremmin soveltuvia molekyylidiagnostisia menetelmiä.

Tuberculosis (TB), caused by the bacterium <i>Mycobacterium tuberculosis</i> (Mtb), is one of the globally most significant infectious diseases. While the incidence rates of TB have been gradually decreasing, the prevalence of nontuberculous mycobacterial (NTM) infections has been reciprocally increasing and may locally exceed that of TB. NTM may cause pulmonary disease clinically indistinguishable from TB. Globally, the environmental opportunist NTM cause significant morbidity especially in the elderly and immunocompromised populations.

The laboratory diagnostics of TB is traditionally based on smear microscopy and culture. Smear microscopy is a rapid method with low sensitivity, whereas culture represents the reference method but may take several weeks. These methods essentially detect acid-fast bacilli and do not differentiate between Mtb and NTM. Since 2010, the World Health Organization (WHO) has endorsed rapid molecular diagnostic (MDx) methods for specific detection of Mtb in clinical samples. In line with the WHO’s End TB strategy, this thesis aimed to evaluate different commercial MDx assays to improve the laboratory diagnostic process for TB, in the clinical setting of Finland, characterized by low TB incidence and small population. In line with the Finnish laboratory diagnostic workflow for TB, both Mtb and NTM were covered in the study.

Altogether, nine different commercial MDx assays were evaluated in the study. Five were evaluated for their potential to replace the established Xpert MTB/RIF Ultra assay (Cepheid; RIF: rifampicin), in rapid detection of Mtb and its rifampicin resistance in clinical samples: Abbott RealTi<i>m</i>e MTB (Abbott Molecular) and Abbott RealTi<i>m</i>e MTB RIF/INH Resistance (Abbott Molecular; INH: isoniazid), Anyplex II MTB/MDR (Seegene; MDR: multidrug-resistant), Allplex MTB/MDRe (Seegene), and STANDARD M10 MDR-TB (SD BIOSENSOR). For the potential to serve as the initial screening method for mycobacteria, two assays detecting and differentiating between Mtb and NTM were evaluated: Anyplex MTB/NTMe (Seegene) and STANDARD M10 MTB/NTM (SD BIOSENSOR). Finally, the FluoroType Mycobacteria assay (Hain Lifescience) was evaluated for replacing the manual GenoType Mycobacterium CM assay (Hain Lifescience) in mycobacterial species identification with mycobacterial cultures.

No evaluated assay was optimally feasible in the clinical setting of the study. While showing appropriate clinical performance for detection of Mtb and excellent performance for rapid drug susceptibility testing for RIF and INH, the RealTi<i>m</i>e system suffered from limitations related to scalability with low sample counts, whereas the M10 system was associated with a biosafety issue related to inefficient inactivation of Mtb. In detection of both Mtb and NTM, the Seegene assays showed weaker clinical performance. In screening use, only the M10 MTB/NTM assay showed adequate clinical performance for replacing smear microscopy, but not culture. Screening with an MTB/NTM assay would likely provide significant benefits in clinical settings currently based on Mtb detection only. In mycobacterial species identification, the FluoroType Mycobacteria assay showed major advancements in workflow compared to the GenoType system but exhibited unexpectedly low identification rates for two commonly isolated NTM species <i>M. intracellulare</i> and <i>M. gordonae</i>.

The study characterized some essential features for optimal MDx testing of mycobacteria in a low TB incidence and small population setting. These include a controllable low- to mid-throughput workflow and a tuberculocidal pretreatment step to ensure biosafety. High clinical performance is essential, including 100% accuracy for Mtb with smear-positive samples. With respect to NTM, however, clinical performance should be evaluated in relation to the local NTM species distribution and preferably to presence of clinical disease. The study results showed that more optimized MDx solutions are still needed.