Differentiation of human pluripotent stem cells into hippocampal cultures

Abstract

This Bachelor’s thesis is a literature review of in vitro differentiation methods in which hippocampal neurons are generated from human-derived stem cells, specifically human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Several methods for differentiating hippocampal neurons were gathered from previous studies and the findings were compared and discussed.

Over the years, novel methods to differentiate hippocampal neurons from cells with human origin have been developed to provide accurate information of hippocampal neuronal functions. The use of hiPSCs offers a unique opportunity to model neuronal networks with patient-specific genetic background. In addition, these cells have better availability compared to human derived tissue samples, which require biopsy. Furthermore, hiPSCs reduce the ethical questions of stem cell therapy, as they can replace the use of embryonic stem cells.

Main findings from the discussed differentiation methods demonstrated the efficacy of specific molecular cocktails, including factors such as Wnt3, brain-derived growth factor (BDNF), SB431542, Cyclopamine, DKK1 and CHIR 99021. Furthermore, many of the methods utilized coculturing with hippocampal astrocytes to direct neuronal differentiation towards hippocampal fate. Characterization techniques, such as immunocytochemistry, were used to successfully confirm the differentiation into hippocampal neurons. Commonly used markers for identifying hippocampal fate were for example PROX1, NEUN, GRIK4 and FOXG1.

The hippocampus is associated with epilepsy, a group of syndromes in which excessive discharge activity occurs, causing epileptic seizures. Approximately a third of the 65 million epilepsy patients do not respond to currently available medications, which is why novel research methods are needed. This thesis briefly discusses research in which differentiated hippocampal neurons have been used to model epilepsy in vitro. The aim of the thesis is to provide the reader with upto-date information about the use and variety of in vitro differentiation methods for hippocampal neurons.

Tämä kandidaatin tutkielma on kirjallisuuskatsaus in vitro erilaistamismenetelmistä, joissa hippokampuksen hermosoluja tuotetaan ihmisperäisistä kantasoluista, erityisesti ihmisen alkion kantasoluista sekä ihmisestä indusoiduista monikykyisistä kantasoluista. Useita menetelmiä hippokampuksen hermosolujen erilaistamiseksi kerättiin yhteen edellisistä tutkimuksista, sekä niiden keskeisimpiä löydöksiä vertailtiin keskenään.

Uusia menetelmiä hippokampuksen hermosolujen erilaistamiseksi ihmisperäisistä soluista on vuosien varrella kehitetty, jotta hippokampuksen hermosoluverkostojen toiminnasta saataisiin tarkempaa tietoa. Ihmisten monikykyisten kantasolujen käyttö antaa ainutlaatuisen mahdollisuuden näiden verkostojen tutkimiseen, sillä ne tarjoavat tutkimuksiin potilaskohtaisen geneettisen taustan. Tällaisten solujen saatavuus on myös parempi verrattuna ihmisen alkuperäisiin kudosnäytteisiin, joiden kerääminen vaatii leikkausta. Lisäksi monikykyiset kantasolut vähentävät kantasoluterapiaan liittyviä eettisiä kysymyksiä, koska niillä voidaan korvata alkion kantasolujen käyttö.

Oleellisimpia löydöksiä tutkimuksista olivat tietyt molekyylisekoitukset, jotka erilaistivat soluja tehokkaasti hippokampuksen soluiksi. Nämä sekoitukset sisälsivät erilaisia kasvutekijöitä, joita olivat esimerkiksi Wnt3, BDNF, SB431542, Cyklopamiini, DKK1 ja CHIR 99021. Lisäksi moni näistä menetelmistä hyödynsi yhteisviljelmiä hippokampuksen astrosyyttien kanssa, mikä ohjasi hermosolujen erilaistumista hippokampaaliseen suuntaan. Viljeltyjen hermosolujen määrittämiseen käytettiin karatkerisointimenetelmiä, kuten immunosytokemiaa, jolla onnistuttiin vahvistamaan erilaistuminen hippokampuksen hermosoluiksi. Yleisimpiä merkkiaineita hippokampuksen hermosolujen ominaisuuksien tunnistamiseksi olivat esimerkiksi PROX1, NEUN, GRIK4 ja FOXG1.

Hippokampus on yhdistetty epilepsiaan eli joukkoon oireyhtymiä, joissa hermosoluissa esiintyy liiallista sähköistä purkaustoimintaa aiheuttaen epileptisiä kohtauksia. Noin kolmasosa 65 miljoonasta epilepsiapotilaasta ei reagoi tällä hetkellä saatavilla oleviin lääkkeisiin, minkä vuoksi uusia tutkimusmenetelmiä tarvitaan. Tässä tutkielmassa käsitellään lyhyesti tutkimuksia, joissa erilasitettuja hippokampuksen hermosoluja on käytetty epilepsian in vitro -mallinnuksessa. Tutkielman tarkoituksena on tarjota lukijalle ajankohtaista tietoa hippokampaalisten hermosolujen in vitro -erilaistamismenetelmien käytöstä sekä niiden valikoimasta.