Computational Methods in CRISPR/Cas9-Gene Editing

Abstract

This thesis explores the computational methods used in CRISPR/Cas9 gene editing, focusing on the design and optimization of single guide RNAs (sgRNAs) to enhance the accuracy and efficiency of gene editing. The study addresses the critical challenge of off-target effects, which can complicate genetic modifications and reduce the reliability of CRISPR applications. This thesis uses computational target finding and analysis to perform an exemplary knockout of the acr1 gene in Acinetobacter baylyi ADP1 to inhibit wax ester production.

The thesis begins with a review of CRISPR technology, providing a foundation for understanding the importance of precise sgRNA design. Then methods are explored, including the target finding tool (FlashFry), the workflow for target discovery, and the scoring of targets based on various metrics. The results emphasize the effectiveness of choosing suitable scoring schemes to identify optimal targets and the importance of manual analysis to complement computational predictions.

The findings display the potential of computational methods to accelerate the gene editing process, reduce trial and error, and enhance the precision of CRISPR gene editing. The thesis concludes with a discussion on these methods for future research and practical applications in medicine, agriculture, and industry, underscoring the need for improved user-friendly tools and standardized scoring algorithms to fully carry out the benefits of computational CRISPR guide design.

Tämä opinnäytetyö tutkii CRISPR/Cas9-geenimuokkauksessa käytettyjä laskennallisia menetelmiä, keskittyen opas-RNA:iden (sgRNA) suunnitteluun ja optimointiin geenimuokkausten tarkkuuden ja tehokkuuden parantamiseksi. Työ käsittelee kriittistä CRISPR/Cas9-geenimuokkauksen haastetta, off-target-vaikutuksia, joka voi monimutkaistaa geneettisiä modifikaatioita ja vähentää CRISPR-sovellusten luotettavuutta. Tämä opinnäytetyö hyödyntää laskennallista targettien löytämistä ja analysointia suorittaakseen acr1-geenin hiljentämisen Acinetobacter baylyi ADP1:ssä vahaestereiden tuotannon estämiseksi.

Opinnäytetyö alkaa kirjallisella katsauksella CRISPR-teknologiaan tarjoten perustan ymmärtää tarkkojen opas-RNA:iden suunnittelun tärkeyttä. Seuraavaksi tarkastellaan menetelmiä, mukaan lukien targettien etsintätyökalu (FlashFry), targettien etsinnän työnkulku ja kohteiden pisteytys eri mittareiden perusteella. Tulokset korostavat sopivien pisteytysjärjestelmien valinnan tärkeyttä optimaalisten targettien tunnistamisessa ja manuaalisen analyysin tärkeyttä laskennallisten löytöjen täydentämiseksi.

Tulokset osoittavat laskennallisten menetelmien potentiaalin nopeuttaa geenieditointiprosessia, vähentää kokeilun ja virheiden määrää, sekä parantaa CRISPR-geenieditoinnin tarkkuutta. Opinnäytetyö päättyy keskusteluun näistä menetelmistä, erityisesti tulevan tutkimuksen ja käytännön sovelluksien näkökulmasta lääketieteessä, maataloudessa ja teollisuudessa. Myös kehityskohteita arvioidaan korostaen käyttäjäystävällisiä työkaluja ja standardoituja pisteytysalgoritmejä laskennallisen targettien etsinnän täysien hyötyjen saavuttamiseksi.