Functional characterization of sequential in vitro model of prostate tumorigenesis

Abstract

Prostate cancer (PCa) is a prevalent malignancy in older males, characterized by its androgen dependence. Androgens like testosterone and dihydrotestosterone (DHT) and their androgen receptor (AR) are crucial for both normal prostate development and PCa. Other contributing factors include genomic alterations. A relatively common event is the fusion between the promoter region of TMPRSS2 and ERG (TMPRSS2-ERG). The fusion gene occurs in approximately 50% of cases, increasing cell migration and invasion potential. Additionally, PTEN tumor suppressor gene deletion, observed in about 60% of PCa cases, contributes to abnormal cell proliferation, invasion, and migration via deregulation of the PI3K/Akt pathway. Despite various model systems to study PCa, there remains a gap for a transformational prostate cell model that does not have post-therapeutic effects and mutations causing bias. To address this, we further characterized an already established normal prostate epithelial RWPE-1 cell line with its subsequent cell lines: RWPE-1-AR (expressing AR), RWPE-1-AR-T2E (expressing both AR and TMPRSS2-ERG), RWPE-1-AR-T2E-PTEN+/- (heterozygous PTEN deletion), RWPE-1-AR-PTEN+/- and RWPE-1-AR-PTEN-/- (homozygous PTEN deletion). Previously, cumate-inducible TMPRSS2-ERG had been introduced into RWPE-1-AR cells via lentiviral-transduction to activate ERG expression upon cumate treatment. PTEN-deletion was carried out with CRISPR. We investigated molecularly and functionally how PTEN deletion, AR expression, and TMPRSS2-ERG fusion affect proliferation, migration, and gene expression. This was accomplished using Western blotting, qRT-PCR, cell proliferation assays (measuring metabolic activity and cell area coverage), and migration assays (wound healing and Transwell inserts). In addition, CRISPR-deleted RWPE-1-AR-T2E-PTEN clones were screened to identify clones with homozygous PTEN deletion. Our results revealed that none of the RWPE-1-AR-T2E-PTEN clones screened displayed a biallelic PTEN deletion, showing either monoallelic deletion or wild-type PTEN. We found that ERG expression increased significantly upon DHT stimulation in RWPE-1-AR-T2E cells, both with and without cumate induction. Proliferation and migration assays indicated that RWPE-1-AR and RWPE-1-AR-T2E cells exhibit similar migration and proliferation properties, with monoallelic or biallelic PTEN deletion further enhancing these characteristics. Despite variability in experimental replicates, the trends remained consistent: PTEN deletion promoted both migration and proliferation, with the strongest effects observed in homozygous PTEN-deleted cells. In conclusion, this study shows that the established RWPE-1 model with its sublines is a valuable tool for modeling early prostate tumorigenesis. Successive genetic alterations including AR expression, TMPRRS2-ERG fusion gene expression, and PTEN deletion, progressively increased cancer-like traits in the RWPE-1 cells. Further CRISPR work is needed to obtain clones with homozygous PTEN deletions. Once fully optimized and characterized, this model could provide significant insights into the early stages of PCa development, particularly in relation to androgen signaling and the PI3K/Akt pathway.

Eturauhassyöpä on yleinen syöpä länsimaailmassa vanhemmilla miehillä. Eturauhassyövän yksi oleellinen piirre on sen riippuvuus androgeeneistä eli miessukupuolihormooneista, toisaalta androgeenit eivät ole ainoita tekijöitä syövän etenemisessä. Androgeenit, kuten testosteroni ja dihydrotestosteroni (DHT) sekä niiden reseptori, androgeenireseptori (AR), ovat tärkeitä eturauhasen normaalille kehittymiselle sekä eturauhassyövän etenemiselle. Muut osalliset tekijät ovat genomitason muutokset. Suhteellisen yleinen muutos eturauhassyövässä on TMPRSS2-promoottorialueen ja ERG:n fuusio, joka tapahtuu noin 50% eturauhassyöpätapauksista. Fuusion seurauksena eturauhassyöpäsolujen vaeltaminen (migrointi) ja tunkeutuminen (invasointi) pois eturauhassyövän alueelta lisääntyy. Lisäksi PTEN-deleetiot (noin 60% eturauhassyövistä) johtavat hallitsemattomaan solujen lisääntymiseen, migroimiseen ja invasointiin PI3K/Akt-signalointireitin sääntelyn puuttumisen vuoksi. Eturauhassolumalleja on saatavilla mm. normaaleina eturauhasepiteelisoluina sekä eturauhassyöpäsoluina. Haasteena on, että eturauhassyöpäsoluissa on jo lääkevaikutuksia sekä erinäisiä mutaatioita, jolloin eturauhassyövän alkuvaiheen mallintaminen osoittautuu haasteelliseksi. Tässä työssä tehtiin funktionaalista karakterisointia eturauhasen normaaliepiteelisolumalli RWPE-1 johdetuille solulinjoille: RWPE-1-AR (ekspressoi AR:ää), RWPE-1-AR-T2E (ekspressoi sekä AR:ää ja TMPRSS2-ERG:iä), RWPE-1-AR-T2E-PTEN+/- (heterotsygoottinen PTEN:n deleetio), RWPE-1-AR-PTEN+/- ja RWPE-1-AR-PTEN-/- (homotsygoottinen PTEN:n deleetio). RWPE-1-AR solulinjaa on aiemmin muokattu lisää transdusoimalla kumaatti-indusoitava TMPRSS2-ERG fuusiogeeni sekä poistamalla PTEN. PTEN-deleetio toteutettiin CRISPR:llä. Solulinjoja tutkittiin karakterisoimalla molekulaarisesti ja funktionaalisesti miten AR:n ja TMPRSS2-ERG:n ekspressiot ja PTEN:n deleetio vaikuttavat proliferaatiohon (solujen lisääntymiseen), migroimiseen sekä geenien ekspressioon. Karakterisointi tehtiin Western blot -tekniikalla, qRT-PCR:llä, solujen lisääntymisen ja migraation analysoinneilla. Lisäksi seulottiin useita PTEN-CRISPR:öityjä RWPE-1-AR-T2E-PTEN klooneja homotsygoottisen PTEN-deleetiokloonin identifioimiseksi. Tuloksista havaitsimme, että yksikään PTEN-deletoitu RWPE-1-AR-T2E-PTEN-klooni ei sisältänyt bialleelista PTEN:n deleetiota. Kloonit olivat PTEN:n suhteen genotyypiltään joko monoalleelisia tai villiä tyyppiä. RWPE-1-AR-T2E-soluilla DHT:n lisäys lisäsi ERG:n ekspressiota merkittävästi ilman kumaattia tai kumaatin kanssa. Proliferaatio- ja migraatiokokeet osoittivat, että RWPE-1-AR- ja RWPE-1-AR-T2E-soluilla migraatio- ja kasvuominaisuudet olivat samanlaiset, ja mono- tai bialleelinen PTEN:n deleetio paransi kyseisiä ominaisuuksia soluissa. Toisaalta replikaateissa oli vaihtelevuutta, mutta trendit pysyivät yhdenmukaisina: PTEN:n deleetio lisäsi solujen migraatiota ja lisääntymistä. Huomattavimmat muutokset migraatioon ja lisääntymiseen huomattiin soluissa, joissa oli homotsygoottinen PTEN:n deleetio. Yhteenvetona, löydöksemme osoittavat, että RWPE-1-AR-T2E-PTEN solumalli on arvokas työkalu varhaisen eturauhaskasvaimen synnyn mallintamiseen. Peräkkäiset geneettiset muutokset RWPE-1 solulinjaan lisäävät asteittain syövälle tyypillisiä ominaisuuksia. Jatkoa varten RWPE-1-AR-T2E-PTEN-kloonien PTEN:n CRISPR-deleetiota tulisi jatkaa homotsygoottista deleetiota varten tarkemman mallin saavuttamiseksi. Lopullinen karakterisointi ja optimointi solumallistamme mahdollistaa solumallin hyödyntämisen eturauhassyövän alkuvaiheen mallintamiseen, etenkin androgeeni- ja PI3K/Akt-signaloinnin suhteen.