Genetic variations in Human opsin genes : Understanding color vision phenotypes and defects

Abstract

Opinnäytetyön tavoitteena on analysoida ihmisen opsiinigeenisekvenssejä keskittyen pitkille aallon pituuksille herkkään OPN1LW- ja keskipituisille aaltopituuksiin herkkään OPN1MW-geeneihin. Tarkoituksena oli tutkia opsiinigeeniklusterin rakenteellisia variaatioita ja vikoja, jotka vaikuttavat värinäköön. Tutkimuksessa käytetään pitkän luennan polymeraasiketjureaktiota, Sanger-sekvensointia sekä kolmannen sukupolven pitkän luennan nanopore-sekvensointia, joka mahdollistaa perimän strukturaalisten varianttien analyysin. Tavoitteena on antaa parempi käsitys värinäköön liittyvistä geneettisistä variaatioista.

Yhteistyössä professori Petri Ala-Laurilan Aalto-yliopiston tutkimusryhmän kanssa tehtiin anomaloskoopilla tarkat väkinäkömääritykset. Aluksi pystytettiin ja optimoitiin jo aikaisemmin julkaistu pitkän luennan polymeraalisketjureaktioon ja Sanger-sekvensointiin perustuva menetelvä alla olevien geneettisten muutosten havaitsemiksi. Opinnäyte koostuu yhdesästätoista koehenkilöstä, jotka ilmentävät eri värinäön ilmiasuja – kolmivärinen (normaali), dikromaattinen (protanopia ja deuteranopia) ja poikkeava trikromatia (protanomalia ja deuteranomalia). Näytteille, joissa ilmiasu ja alustava metodi eivät tuottaneet yhteneviä tuloksia. Suomen Molekyylilääketieteen instituutti (FIMM) suoritti näytteiden eristyksen painottaen korkean molekyylipainon (HMW) DNA-fragmentteja, erittäin pitkää nanopore-sekvensointia varten.

Sanger-sekvensoinnilla tunnistimme dikromaattiset fenotyypit, havaiten, että eksonin 3 ohittaminen sekä tietyt SNP-yhdistelmät vaikuttavat valon havaitsemisen spektriherkkyyteen. Tutkimuksessa havaittiin, että jotkin geneettiset ja funktionaaliset diagnoosit poikkesivat toisistaan. Näitä tutkimme tarkemmin nanopore-sekvensoinnilla, rakenteellisten varianttien paljastamiseksi. Kolmen näytteen nanopore-sekvensointianalyysi paljasti opsiinigeeniklusterin rakenteellisia variantteja, jotka mahdollisesti vaikuttavat värinäköön. Huolimatta nanopore-sekvensoinnin mahdollisuuksista, haasteet, kuten lukusyvyys ja sekvenssinlijausongelmat, olivat yleisiä, erityisesti erotettaessa opsiinigeenien erittäin homologisia geenialueita toisistaan. Tutkimus korosti teknisten parannusten ja validoinnin tarvetta vaihtoehtoisilla menetelmillä geneettisten muutosten tarkkaan tulkitsemiseen ja artefaktien välttämiseen.

Alustavat havainnot osoittavat haasteita OPN1LW- ja OPN1MW-geenisekvenssien ratkaisemisessa niiden suuren sekvenssien samankaltaisuuden vuoksi. Perinteisillä sekvensointimenetelmillä on usein vaikeuksiasekvensoida opsiinigeenit onnistuneesti, mikä johtaa moniselitteisyyteen variantin tunnistamisessa ja alleelimäärityksessä. Rajoituksista huolimatta nanopore-sekvensoinnin kyky tuottaa erittäin pitkiä fragmentteja mahdollistaa suurten rakenteellisten varianttien havaitsemisen, jotka jäävät helposti huomaamatta lyhyen lukujakson tekniikoilla.

Opinnäytetyö auttaa ymmärtämään värinäön poikkeavuuksien perinnöllisiä tekijöitä, sekä korostaa edistyneiden sekvensointitekniikoiden tarvetta erittäin homologisten alueiden tutkimisessa. Nanopore-sekvensointi, rajoituksistaan huolimatta, on lupaava menetelmä suurten rakenteellisten muutosten havaitsemiseen. Se tarjoaa tarkempaa ymmärrystä värinäön genetiikasta ja on lupaava työkalu tulevaisuuden diagnostiikalle ja hoitostrategioille värinäköhäiriöiden suhteen.

The objective of this thesis is to analyze human opsin gene sequences, focusing on the long-wavelength-sensitive OPN1LW and medium-wavelength-sensitive OPN1MW genes, and investigate structural variants and defects within the opsin gene cluster that impact color vision. Utilizing long-read PCR, Sanger-sequencing, and 3rd-generation long-read sequencing (Oxford nanopore), which allows real-time DNA sequence analysis, the study aims to provide a better understanding of genetic variations associated with defective color vision.

In collaboration with Professor Petri Ala-Laurila’s research group at Aalto University, the color vision defects were determined with an anomaloscope. First, a previously published method of long-range PCR and sequencing was set up and optimized in the laboratory to identify variations in the OPN1LW and OPN1MW genes. Nineteen subjects with various color vision phenotypes—trichromatic, dichromatic (protanopia and deuteranopia), and anomalous trichromacy (protanomaly and deuteranomaly)—were analyzed with long-range-PCR and Sanger sequencing. For the samples where discrepancies exist, the Finnish Institute of Molecular Medicine (FIMM) helped to produce high-quality genomic DNA fragments with high molecular weight (HMW) DNA for ultra-long-read nanopore analysis.

Sanger sequencing identified dichromatic phenotypes, suggesting that exon 3 skipping and specific SNP combinations affect spectral sensitivity, with certain haplotypes. The study found that some genetic and functional diagnoses diverged, warranting further nanopore sequencing to reveal possible structural variants. The nanopore sequencing analysis of two samples revealed insights into the genetics of the opsin gene cluster, with implications for understanding color vision. Despite the potential of nanopore sequencing, challenges such as read depth and alignment issues were prevalent, particularly in distinguishing between highly homologous gene regions like OPN1LW and OPN1MW. The study underscored the necessity of technical improvements and validation through alternative methods to accurately interpret genetic variations and avoid artifacts.

The findings indicate challenges in resolving OPN1LW and OPN1MW gene sequences due to their high sequence similarity. Traditional sequencing methods often struggle to accurately resolve these genes, leading to ambiguity in variant identification and allele assignment. Despite limitations, nanopore sequencing's ability to generate ultra-long reads allows for the detection of large structural variants easily missed by short-read technologies, contributing to a deeper understanding of color vision deficiencies.

In conclusion, the thesis provides insights into the genetic determinants of color vision deficiencies, highlighting the need for advanced sequencing technologies to overcome the challenges of resolving highly homologous regions. Nanopore sequencing, despite its limitations, shows promise in detecting large genomic variations, offering a more precise understanding of color vision genetics and paving the way for improved diagnostic and treatment strategies for color vision disorders.