Mapping the fate of nanoerythrosomes inside HeLa cells by FLIM technique

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) are one of the recent key and intriguing research subjects as carriers of drugs, diagnostic tools, and therapeutic products, however their mechanisms are not yet well understood. Since EVs are heterogeneous particles a homogeneous reference particle that resembles the EVs as much as possible is needed. The nanoerythrosome has been suggested to be such a particle. Nanoerythrosomes are artificial vesicles that can be prepared from the remnants of red blood cell membranes. The transport of fluorescently labeled nanoerythrosomes into cells and their potential release within the cell can be studied using time-resolved and steady-state fluorescence spectroscopy. In this master's thesis, the transport of a lipid conjugate of a BODIPY fluorophore (BP) labeled nanoerythrosomes (NERs) into HeLa cells and their release within the cell was stud-ied. The aim was to study the changes in fluorescence lifetime and the connection to the release of labeled NERs. The transport into cells was studied using fluorescence lifetime microscopy (FLIM), and as a comparison, cells were also measured with the free dye used for labeling the nanoerythrosomes. Due to a malfunction in the equipment, the direction of the study was slightly altered to also investigate the labeling of NERs with two fluorescent labels simultaneously, as well as the mixture of NERs, which were separately labeled with different dyes. The labels used were BP and a lipid conjugate of rhodamine B (RB). Labeling was performed using size-exclusion chromatography, and if there was a clear separation between the labeled NERs and the free dye in the eluate, the labeling was considered successful. The fluorescent properties of the labeled NERs were further studied with steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. The aim was to utilize the Förster resonance energy transfer (FRET) for monitoring the NER opening inside the cells. In FLIM studies, it was observed that at least some labeled NERs open and release the dye, which can diffuse into other cell membranes. BP-labeled NERs are also likely taken into the cell by endocytosis. In time-resolved fluorescence measurements, it was observed that no energy transfer takes place between the dyes when the NERs were labeled with two dyes (BP and RB). However, the BP fluorescence was quenched in the mixture of NERs labeled separately with the two dyes (BP and RB). Since energy transfer was not observed for the NERs simultaneously labeled with BP and RB, this FRET- pair is not suitable for monitoring the opening of NERs inside cells.

Solunulkoiset vesikkelit (EVt) ovat yksi viimeaikojen keskeisimpiä ja kiinnostavimpia tutkimuksen kohteita lääkeaineiden kuljettajina, mutta niiden toimintaa ei vielä tunneta kovin hyvin. Koska EVt ovat heterogeenisiä partikkeleita , tarvitaan tarkempia tutkimuksia varten niitä mahdollisimman paljon muistuttava homogeeninen referenssipartikkeli – nanoerytrosomi (NER). Nanoerytrosomit ovat keinotekoisia vesikkeleitä, joita voidaan valmistaa punasolujen solumembraanien jäänteistä. Fluoresenssileimoilla leimattujen nanoerytrosomien kulkeutumista soluun, sekä niiden mahdollista avautumista solun sisällä voidaan tutkia aikaerotteisella ja stationäärisellä fluoresenssi spektroskopialla. Tässä diplomityössä tutkittiin BODIPY fluoroforin lipidikonjugaateilla (BP) leimattujen nanoerytrosomien kulkeutumista HeLa soluihin ja niiden avautumista solun sisällä. Tarkoituksena oli tutkia fluoresenssinelinajan muutoksia ja sen yhteyksiä leimattujen NER:n avautumiseen. Kulkeutumista soluihin tutkittiin elinaikaerotteisella fluorresenssimikroskopialla (FLIM) ja vertailuna väriaineella leimatuille nanoerytrosomeille mitattiin myös soluja vapaan väriaineen kanssa. Laitteistosta johtuvan vian vuoksi tutkimuksen suuntaa kuitenkin muutettiin hieman ja nanoerytrosomien soluun kulkeutumisen lisäksi tutkittiin NER:n leimaamista kahdella fluoresenssileimalla samanaikaisesti, sekä kahdella eri leimalla leimattujen NER:n sekoitusta. Leimoina käytettiin BP:tä ja rodamiini B:n lipidikonjugaattia (RB). Leimaaminen tapahtui kokoekskluusiokromatografiaa hyödyntämällä. Mikäli leimattujen NER:n ja vapaaksi jääneen väriaine-eluetin erottumisen välillä oli selkeä ero, oli leimaus onnistunut. Leimattujen NER:n fluoresenssi ominaisuuksia tutkittiin stationaarisella ja aika-erotteisella fluoresenssi spektroskopialla. Tavoitteena oli tutkia Försterin resonanssienergiansiirron (FRET) hyödyntämistä leimattujen NER:n avautumisen tutkimisessa. FLIM tutkimuksissa havaittiin, että ainakin osa leimatuista NER:sta aukeaa ja vapauttaa väriaineen, joka pääsee laimenemaan solun muihin membraaneihin. BP-leimatut NER:t myös todennäköisesti otetaan soluun endosytoosilla. Aika-erotteisilla fluoresenssimittauksilla puolestaan havaittiin, että kahdella leimalla (BP ja RB) leimatuissa NER:ssä ei väriaineiden välillä ei tapahdu energian siirtoa, kun taas kahden eri leimalla leimatun (BP ja RB) NER:n seoksessa havaittiin BP:n fluoresenssin sammumista. Koska energian siirtoa ei havaittu kahdella leimalla leimatuissa NER:ssä, tämä FRET-pari ei sovellu NER:ien solunsisäisen avautumisen tutkimiseen.