Isolating cells from zebrafish eyes with laser capture microdissection

Abstract

The mouse has proven to be a great model in biomedical research. However, in eye research, mice show multiple limitations due to being nocturnal animals with poor eyesight. In addition, mice cannot see red light due to absence of red cone photoreceptors. Zebrafish, on the other hand, are diurnal species with high-acuity vision and excellent colour vision like humans. However, due to the small size of the eye, isolating cells for gene expression analysis remains a problem, as the samples isolated via conventional dissection methods are not reaching adequate purity. In order to solve this problem, other cell isolation methods, such as laser capture microdissection (LCM), have been considered to be used instead. This thesis focused on characterising the molecular signature of the zebrafish RPE. In order to do so, the potential of a conventional dissection method and the LCM technique as cell isolation methods was evaluated. The conventional dissection method involved the removal of the cornea, lens, and vitreous from the eye with a scalpel and forceps, followed by the detachment of the retina and ultimately the isolation of retinal pigment epithelium (RPE) cells from the choroid with a hyaluronidase mix. The ArcturusXT LCM system was used to isolate zebrafish RPE, outer nuclear layer (ONL), and choroid. Furthermore, the area where the RPE microvilli and photoreceptor outer segment (POS) overlap was isolated to determine whether it had sufficient quantity and quality of messenger ribonucleic acid (mRNA). The specimens used in this study were 14–18-month-old zebrafish whose eyes were dissected with a cryostat into thin 8–20 μm sections and mounted on PEN membrane glass slides prior to the LCM. The LCM isolates were collected with CapSure™ Macro LCM Caps, from which the mRNA was extracted using the RNeasy Micro Kit. The quantity of the extracted mRNA was measured with a spectrophotometer, and the quality was assessed with a fragment analyser. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was performed on conventionally dissected samples to evaluate the purity of the samples. In addition, RT-PCR analysis was performed for 20 potential zebrafish RPE genes to study their expression in the zebrafish RPE. The conventional dissection technique was found to be insufficient for producing zebrafish RPE and retinal samples of adequate purity. Cells were isolated from 8 zebrafish eyes with the LCM technique for two mRNA samples: ONL and RPE microvilli-photoreceptor outer segment (POS). The quality and quantity of the extracted mRNA in the ONL sample were sufficient for potential downstream analysis. The area of the RPE microvilli-POS, on the other hand, was found to have inadequate mRNA quality and yield to confound the purity of the RPE or the ONL samples. The zebrafish RPE obtained by conventional dissection was shown to express all genes of interest; however, their expression is difficult to confirm as the only available samples were cross-contaminated according to previous RT-PCR analysis. In conclusion, the LCM technique shows great promise for isolating zebrafish ONL. However, due to the small number of samples, the reproducibility of the results cannot be guaranteed. Because of this, the analysis must be repeated with other zebrafish ONL samples, as well as with the zebrafish RPE and choroid. This will be done as part of the following study.

Hiiri on osoittautunut erinomaiseksi mallieläimeksi biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Silmätutkimuksessa hiirillä on kuitenkin useita rajoituksia siksi, että ne ovat yöeläimiä, joilla on huono näkö. Lisäksi hiiret eivät kykene näkemään punaista valoa, sillä hiiren verkkokalvo ei sisällä punaiselle valolle herkkiä tappisoluja. Seeprakalat puolestaan ovat päiväaktiivisia ja omaavat sekä hyvän näöntarkkuuden että varinäon kuten ihmiset. Silmän pienen koon vuoksi solujen eristäminen geeniekspressioanalyysiä varten on kuitenkin edelleen ongelma, koska tavanomaisilla dissektiomenetelmillä kerätyt näytteet eivät välttämättä saavuta riittävää puhtautta. Tämän vuoksi muita solujen eristämismenetelmiä, kuten laserkaappausmikrokrodissektiota (eng. LCM), on harkittu ongelman ratkaisemiseksi. Tässä opinnäytetyössä keskityttiin seeprakalan RPE:n molekyylijäljen karakterisointiin. Tätä varten arvioitiin tavanomaisen dissektiomenetelmän, sekä LCM-tekniikan potentiaalia solujen eristämismenetelminä. Tavanomaiseen dissektiomenetelmään sisältyi sarveiskalvon, linssin ja lasiaisen poistaminen silmästä skalpellilla ja pinseteillä, minkä jälkeen verkkoralvo irroitettiin silmän takaosasta. Lopuksi verkkokalvon pigmenttiepiteelisolut (eng. RPE cells) irroitettiin suonikalvosta hyaluronidaasiseoksella. ArcturusXT LCM -järjestelmää käytettiin tässä tutkimuksessa seeprakalan RPE-solujen, verkkokalvon ulomman tumakerroksen (eng. ONL) ja suonikalvon eristämiseen. Lisäksi soluja eristettiin alueelta, jolla RPE-mikrovillukset ja fotoreseptorien ulompi segmentti (eng. POS) menevät päällekkäin. Tämän tarkoitus oli tutkia, sisältyykö alueeseen suuria määriä korkealaatuista lähetti-ribonukleiinihappoa (eng. mRNA). Tässä tutkimuksessa käytetyt seeprakalayksilöt olivat 14–18 kuukauden ikäisiä. Seeprakalojen silmät leikattiin kryostaatilla 8–20 mikrometrin ohuisiksi siivuiksi ja kinnitettiin PEN-kalvonäytelaseihin ennen laserkaappausmikrodissektiota. Eristetyt solut kerättiin CapSureTM Macro LCM -kansiin, joista mRNA eristettiin RNeasy Micro Kit -protokollan mukaisesti. Eristetyn mRNA:n määrä mitattiin spektrofotometrillä ja laatu arvioitiin fragmenttianalyysin avulla. Tavanomaisesti dissektoiduille näytteille suoritettiin käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktioanalyysi (eng. RT-PCR analysis) näytteiden puhtauden arvioimiseksi. Lisäksi RT-PCR-analyysi suoritettiin 20 potentiaaliselle seeprakalan RPE-geenille niiden ilmentymisen tutkimiseksi seeprakalan RPE:ssä. Tavanomaisen dissektiomenetelmä todettiin olevan kykenemätön tuottamaan puhtaita seeprakalan RPE- ja verkkokalvonäytteitä. LCM-tekniikkaa käytettiin solujen eristämiseen kahdeksasta seeprakalan silmästä, mikä mRNA riitti kahden näytteen, yhden ONL-näyteen ja RPE-mikrovillus-POS -näytteen, valmistamiseen. Eristetyn mRNA:n laatu ja määrä ONL-näytteessä todettiin riittävän jatkoanalyyseihin. RPE-mikrovilli-POS-alueen puolestaan havaittiin sisältävän vain pieniä määriä huonolaatuista mRNA:ta. Näin ollen tämä alue ei todennäköisesti tule vaikuttamaan muiden RPE- tai ONL-näytteiden puhtauteen. RT-PCR analyysin avulla todettin, että tavannomaisella dissektionmenetelmällä eristetty seeprakalan RPE ilmaisee kaikkia tutkittavia RPE-geenejä. Niiden ilmentymistä on kuitenkin vaikea vahvistaa, koska ainoat käytettävissä olevat näytteet olivat ristikontaminoituneita aiemman RT-PCR-analyysin perusteella. Yhteenvetona voidaan todeta, että LCM-tekniikka näyttää soveltuvan ONL:n eristämiseen seeprakalan silmästä. Pienen näytemäärän vuoksi ei kuitenkaan ole vielä mahdollista varmistaa tuloksien uusittavuutta. Tästä johtuen analyysi on toistettava muilla seeprakalan ONL-näytteillä, sekä seeprakalan RPE:lla ja suonikalvolla. Tämä aiotaan tehdä osana tulevaa tutkimusta.