Molecular Mechanisms of Cell Adhesion and Cytoskeletal Dynamics Underlying Human Mesenchymal Stem Cell Differentiation

Abstract

Kantasolujen erilaistuminen kudosten kehittymisen ja uusiutumisen aikana on monitahoinen ja monivaiheinen prosessi, johon liittyy aikaan ja paikkaan sidottu säätely. Mesenkymaaliset kantasolut ovat mesodermistä peräisin olevia monikykyisiä esisoluja, jotka pystyvät erilaistumaan rasva- ja luusoluiksi. Erilaistumiskykynsä vuoksi nämä aikuisen kantasolut ovat mielenkiintoisia kandidaatteja käytettäväksi pehmytkudoksen ja luukudoksen uusiutumisessa ja kudosteknologiassa. Ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumista ohjaavat molekulaariset tekijät ja mekanismit tunnetaan vielä huonosti, sillä pääosa aiemmista tutkimuksista on tehty eläinmalleissa.

Tässä väitöskirjassa ihmisen rasvakudoksesta (rasvan kantasolut) tai luuytimestä (luuytimen kantasolut) kerättyjä mesenkymaalisia kantasoluja tutkittiin <i>in vitro.</i> Mesenkymaalisten kantasolujen rasva- ja luuerilaistumista indusoitiin biokemiallisesti. Lisäksi solujen luuerilaistumista indusoitiin bioaktiivisesta lasista uutettujen ionien avulla. Keskeisten ja evolutiivisesti konservoituneiden solujen kiinnittymiskykyä ja solutukirankaa säätelevien proteiinikinaasireittien merkitystä tutkittiin mesenkymaaliste kantasolujen erilaistumispotentiaalin ohjaajina. Fokaaliadheesiokinaasi (FAK) on tärkeä solujen kiinnittymisen säätelijä, joka välittää signaaleja useiden kohteiden, kuten mitogeeniaktivoitu proteiinikinaasi (MAPK)- signaalireittien kautta. Aktiinitukirangan dynamiikkaa säätelee Rho-kinaasi (ROCK)- signalointi. ROCK-signaalireitin alavirran puoleinen MRTF-A-transkriptiotekijä toimii kiehtovana yhdistäjänä tukirangan dynamiikan ja geenien luennan välillä. Näiden solunsisäisten signalointireittien merkitystä ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumiselle tutkittiin käyttäen signaalinvälityksen inhibiittorimolekyylejä.

Tulokset osoittavat, että FAK-signaloinnin välittämä soluadheesio toimii molekulaarisena kytkimenä rasvan kantasolujen erilaistumissuunnan valinnassa rasva- ja luusolujen suuntaan. FAK-signaloinnin aktiivisuus suosi luuerilaistumista, mutta FAK-inhibition aikaansaama heikentynyt kiinnittyminen lisäsi rasvaerilaistumista ihmisen rasvan kantasoluissa. FAK-signalointiin kytköksissä olevan MAPK ERK-signaloinnin aktiivisuuden havaittiin olevan merkittävää sekä rasva- että luuerilaistumisen kannalta ihmisen rasvan kantasoluissa. Tulosten perusteella FAK- ja ERK-signaalireiteillä on erilliset roolit erilaistumissuunnan säätelyssä.

ROCK-signaloinnin ja MRTF-A-transkriptiotekijän havaittiin säätelevän ihmisen rasvan kantasolujen erilaistumissuuntaa solutukirangan muutosten avulla. ROCK- aktiivisuuden aikaansaama aktiinin polymerisaatio ja supistumiskyky mahdollistivat luuerilaistumisen. ROCK-inhibitio lisäsi solunsisäisten lipidipisaroiden määrää ja kokoa, mikä indikoi rasvasolujen maturaatiosta. MRTF-A-signaloinnin aktiivisuus todettiin tärkeäksi ihmisen rasvan kantasolujen luuerilaistumissuunnalle. MRTF-A- transkriptiotekijän tumakuljetuksen estäminen sai aikaan muutoksia aktiinitukirangassa ja lisäsi rasvaerilaistumista.

Tulokset osoittavat, että kokeellisesta booria sisältävästä bioaktiivisesta lasista uutetut ionit ovat vahvoja luuerilaistumisen indusoijia ihmisen rasvan ja luuytimen kantasoluissa. Tutkimuksessa kuvaillaan uudenlainen rooli p38 MAPK/ lämpöshokkiproteiini 27 (HSP27) -signaloinnille ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen luuerilaistumisessa. Bioaktiivinen lasi indusoi varhaisen ja lyhytaikaisen p38 MAPK/HSP27-reitin aktivaation, ja HSP27-fosforylaation inhibitio heikensi luuerilaistumista. Tulosten perusteella solutukirangan ja fosforyloidun HSP27:n assosiaatio voisi toimia ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen luuerilaistumisen varhaisena säätelijänä.

Väitöskirjan tutkimukset lisäisivät biologista tietoa ja ymmärrystä ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumisen taustalla, minkä avulla voidaan kehittää tietopohjaisia kudosteknologisia menetelmiä ja ratkaisuja rasva- ja luukudokseen liittyvien sairauksien hoitamiseen.

Stem cell differentiation during tissue development and regeneration is a complex multistep process involving temporally and spatially orchestrated regulation. Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent progenitor cells of mesodermal origin that differentiate into adipocytes and osteoblasts. The differentiation capacity of these adult stem cells marks them as intriguing candidates for soft and bone tissue regeneration and engineering. However, the molecular factors and mechanisms involved in the regulation of MSC differentiation have been studied using primarily animal models and human MSC differentiation remains understudied.

In this thesis, human MSCs harvested from adipose tissue (human adipose stem cell; hASC) or bone marrow (human bone marrow stem cell; hBMSC) were studied <i>in vitro</i>. Adipogenic or osteogenic differentiation of hMSCs was induced with biochemical agents in culture medium. Additionally, the cells were cultured under ions extracted from bioactive glass (BaG) to stimulate osteogenic differentiation. Central and evolutionarily conserved protein kinase pathways related to cell adhesion and cytoskeletal dynamics were studied in the context of directing hMSC differentiation potential. Focal adhesion kinase (FAK) is a key regulator of cell adhesion that mediates signaling through various targets, including mitogen- activated protein kinase (MAPK) pathways. Actin cytoskeleton dynamics are modulated by the Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) pathway. The ROCK downstream target, myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) serves as an intriguing link between cytoskeletal dynamics and gene expression. The roles of these intracellular signaling pathways in hMSC differentiation were studied using small- molecule inhibitors of signal transduction.

The results demonstrate that cell adhesion mediated by FAK signaling acts as a molecular switch between adipogenic and osteogenic differentiation of hASCs. FAK pathway activity favored the osteogenic outcome of hASCs, but inhibition of cell adhesion by FAK inhibition resulted in enhanced adipogenesis. The activity of the FAK downstream target MAPK extracellular signal-regulated kinase (ERK) was found to be significant for both the adipogenic and osteogenic differentiation of hASCs. These results indicate that FAK and ERK pathways have distinct roles in the regulation of lineage commitment.

Based on the results, the ROCK pathway and MRTF-A are relevant regulators of the hASC lineage commitment through cytoskeletal modulation. We demonstrated that actin polymerization and contractility induced by ROCK activity are required for osteogenesis. ROCK inhibition enhances the number and size of intracellular lipid droplets, thus suggesting adipogenic maturation. Active MRTF-A signaling is important for the osteogenic course of hASCs. Inhibition of nuclear translocation of MRTF-A resulted in changes in actin cytoskeleton and enhanced adipogenic fate.

The results revealed that ions dissolved from the experimental boron-containing BaG are strong inducers of osteogenesis in hASCs and hBMSCs. A novel role in the context of hMSC osteogenesis was discovered for the MAPK family member p38/heat shock protein 27 (HSP27) signaling. Activation of the p38 MAPK/HSP27 pathway occurred early and temporally during BaG-induced osteogenesis, and inhibition of HSP27 phosphorylation decreased osteogenic differentiation. The results suggest that the cytoskeletal association of phosphorylated HSP27 could function as an early regulator in the osteogenic commitment of hMSCs.

The study results reported in this thesis increase the biological knowledge and understanding of hMSC differentiation and provide a background for knowledge- based solutions in tissue engineering and for the treatment of bone and adipose tissue-related disorders.