Polycomb Repressive Complex 2-mediated Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis and Differentiation in Health and in Coeliac Disease

Abstract

Ohutsuolen pintaepiteelikerros muodostuu useista eri solutyypeistä, jotka ovat vastuussa niin ravinnon imeytymisestä kuin patogeeneiltäkin puolustautumisesta. Suoliston epiteelin homeostaasi on suoliston kantasolujen uudistumiskyvyn ja erilaistumisen välistä tasapainoilua. Kanoninen Wnt/β-kateniini-signalointireitti säätelee tätä järjestelmää, mutta epigeneettisten tekijöiden osuutta ei vielä täysin ymmärretä. Hiiren ohutsuolesta eristettyjä kantasoluja sisältäviä kryptiä voidaan viljellä kolmiulotteisessa matriisissa. Tämä tukirakenne tarjoaa kantasoluille mahdollisuuden jakautua ja erilaistua kohti enterosyyttejä sopivien kasvutekijöiden läsnäollessa elatusnesteessä. Viljellyt solut muodostavat kryptien kaltaisia ulokkeita ja nukkalisäkkeen, jotka muistuttavat läheisesti ohutsuolen muotoa ja toimintaa. Nämä mini-suoliksi kutsutut organoidit läpikäyvät saman erilaistumisprosessin kantasoluista enterosyyteiksi, pikarisoluiksi, Panethin soluiksi ja muiksi solutyypeiksi läpikäyden lopuksi apoptoosin elinkaarensa lopussa aivan kuten luonnollisessa suolistossa. Hypotetisoimme, että Polycomb Repressive Complex 2 (Polycomb säätelyjärjestelmä, PRC2) vaikuttaa suoraan Wnt-signalointireitin säätelemään homeostaasiin, ja että näissä tapahtuvat epänormaalit muutokset krypta-villus- akselilla yhdistävät keliakiaa ja muita suolistollisia pahanlaatuisia muutoksia. Käytimme uuden sukupolven sekvensointimenetelmiä tutkiaksemme PRC2:n toimintaa ohutsuolen epiteelissä. Näillä genomisekvensointityökaluilla pystyimme kartoittamaan koko genomin laajuisia muutoksia kantasolujen erilaistuessa enterosyyteiksi.

Huomasimme, että PRC2:n katalysoima geenin luentaa vaimentava epigeettinen histoni H3 lysiini 27:n kolmoismetylaatio (H3K27me3) muokkaus oli läsnä niissä kryptille ja villuksille tyypillisissä geeneissä, jotka vaikuttavat muunmuassa solujen jakautumiseen ja erilaistumiseen. Tunnistimme 90 PRC2:n kohdegeeniä, jotka oli vaimennettu joko kryptissa tai villuksissa. Tämän johdosta voisimme olettaa, että PRC2 säätelee, kuten Wnt-signalointi, homeostaasia suolen epiteelissä. Syövässä, kuten kolorektaaliadenoomassa, PRC2:n kohdegeenit olivat havaintojemme mukaan eri tavalla ilmentyneitä. Lisäksi tunnistimme 12 aikaisemmin tuntematonta PRC2 säädeltyä transkriptiotekijää, jotka toimivat M-solujen erilaistumisprosessissa. Näihin lukeutui myös M-solujen kypsymiseen liittyvä transkriptiotekijä Esrrg. Tätä tekijää tarvitaan M-solujen kehittymiseen, ja huomasinne, että Esrrg:n poisto estää M-soluja tuottamasta Sox8 ja Gp2 proteiineja, joita vaaditaan M-solun kypsymiseen.

Keliakiassa havaitsimme, että PRC2:n osa, SUZ12 proteiini, on ilmentynyt tavanomaisen alueensa ulkopuolella kryptien ja villusten välisesssä osiossa, kun käytössä oli gluteenipitoinen ruokavalio. Wnt-signalointi oli yliaktiivinen näiden potilaiden ohutsuolen epiteelissä. Keliakiapotilailla tehdyssä gluteenialistuskokeessa näimme eri tavalla ilmentyneitä geenejä verrattua gluteenittomaan ruokavalioon. Gluteenialtistus myös aktivoi Wnt-signalointireitin hyperaktiiviseen tilaan, josta seurasi häiriintynyt kryptan geenien ilmentyminen ja vähemmän kehittynyt epiteelisolukko. Tämä patogeeninen Wnt-signaloinnin tila on ilmeisesti käynnissä keliakiassa myös gluteenittomalla ruokavaliohoidolla. Pystyimme myös mallintamaan taudinkuvan muodostumista molekyylimerkkiaineista ilman klassista histologista koepalapohjaista tulkintaa.

PRC2:n katalysoima H3K27me3 epigeneettinen muokkaus on läsnä keskeisissä kehitykseen liittyvissä geeneissä. Yhdessä kaikki tuloksemme viittaavat siihen, että PRC2 ylläpitää kryptien ja villusten H3K27me3 tasapainoa, ja tunnistamamme kohdegeenit voisivat olla olennaisia tekijöitä ohutsuolen kantasolujen ylläpidossa ja erilaistumisessa sekä enterosyyttien ja M-solujen kypsymisessä. Keliakian kryptien hyperplasia sekä muut vastaavat pahanlaatuiset muutokset, kuten neoplasia voisivat olla PRC2:n kantasolumaisuutta edistävän toiminnan aikaansaannosta suoliston epiteelissä.

The surface epithelium of the small intestine harbours multiple cell types that are responsible for nutrient intake and defence from pathogens. Homeostasis of the intestinal epithelium is an interplay between intestinal stem cell self-renewal and differentiation. The canonical Wnt/β-catenin signalling pathway regulates this process but epigenetic factors in this process are not fully understood. Mouse small intestinal crypts that contain stem cells can be cultured in three dimensional matrix. This support structure for the stem cells allows them to divide and differentiate toward enterocytes when a proper mix of growth factors is present in the culture medium. The cells form crypt like buds that mimic the small intestine’s form and function. These organoids or mini-guts as they are called undergo the same differentiation from stem cells to enterocytes, goblet cells, Paneth cells and others and finally to apoptosis as <i>in vivo</i> intestine.

We hypothesized that Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) is affecting epithelial homeostasis regulated by the Wnt signalling pathway. Abnormal changes in the crypt-villus axis are implicated both in coeliac disease and in intestinal malignancies. We subjected the mini-guts to chromatin immunoprecipitation- and global run on sequencing methods to study the function of PRC2 in the small intestine. These next generation sequencing tools allowed us to assess genome wide changes during differentiation from stem cells to enterocytes.

We found that histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) repressive mark, catalysed by PRC2, was present in crypt and villus expressed genes that are responsible e.g. proliferation and differentiation. We identified 90 PRC2 target genes that were silenced along the crypt-villus axis. This would suggest that Wnt- mediated homeostasis is also involves PRC2. In colorectal adenoma and carcinomas we also noticed an indication that PRC2 target genes had different expression patterns between healthy and diseased. In addition, 12 previously unknown PRC2-regulated transcription factors were identified that are involved in M-cell differentiation. These include a novel M-cell maturation related transcription factor Esrrg that is regulated by PRC2. Esrrg is required for M-cell development and the loss of Esrrg prevents M-cells to effectively express Sox8 and Gp2 maturation markers.

In coeliac disease, we could see out of bounds expression of PRC2 member SUZ12 in TA-zone while the patients were on gluten containing diet. Wnt-signalling was overactive in the small intestine of coeliac disease patient. In gluten challenge trial we could see differentially expressed gene sets between patients on gluten free diet and gluten containing diet. Gluten challenge also made the intestinal Wnt signalling pathway hyperactive leading to immature crypt gene expression and less mature epithelium. This pathogenic Wnt-state seems to be on in coeliac patients even when they are on a gluten free diet. We also could model a tool to predict disease onset from molecular markers instead of classical histological reading.

PRC2 specific H3K27me3 signature is present on fundamental developmental genes. Combined, our results would indicate that PRC2 maintains crypt and villus H3K27me3 signature and the targets we identified could be essential factors in intestinal stem cell maintenance and differentiation and enterocyte and M-cell maturation. Coeliac disease crypt hyperplasia and other intestinal malignancies that include epithelial hyperplasia or neoplasia could be driven by PRC2 mediated pro-stemness in the epithelium.