Production, Functional Characterization and Inhibition of Carbonic Anhydrases of Parasites

Abstract

Hiilihappoanhydraasit (carbonic anhydrase, CA) ovat metalloentsyymejä, joita esiintyy kaikkialla elollisessa luonnossa. Niiden tehtävä on katalysoida elintärkeää käänteistä reaktiota: hiilidioksidin hydraatiota hiilihapoksi (CO2 + H2O ⇋ H2CO3 ⇋ HCO3- + H+). Reaktio on osana monissa fysiologisissa ja metabolisissa prosesseissa, kuten happo-emästasapainon säätelyssä, glukoneogeneesissa ja yhteyttämisessä. Hiilihappoanhydraasit jaetaan yhteensä kahdeksaan perheeseen, joista ihmisillä esiintyy vain ensimmäisenä löydettyä α-entsyymiperhettä. Monilla taudinaiheuttajilla, kuten bakteereilla ja loisilla, on myös muiden hiilihappoanhydraasiperheiden proteiineja. <i>Schistosoma mansoni</i> on suolistotulehdusta aiheuttava halkiomato, jota esiintyy endeemisenä monilla trooppisilla ja subtrooppisilla seuduilla. <i>Entamoeba histolytica</i> ja <i>Acanthamoeba castellanii</i> ovat ihmisille infektioita aiheuttavia ameboja. <i>E. histolytica</i> aiheuttaa suolistotulehdusta ja <i>A. castellanii</i> pääasiassa sarveiskalvon tulehdusta, sekä immuunipuutteisille henkilöille myös syviä infektioita. Yhteistä näille loisille on, että niiden diagnostiikassa tai hoidossa on puutteita, ja ne ovat globaalisti erittäin yleisiä. Niiden aiheuttamat sairaudet voivat olla tappavia, ja aiheuttavat lievimmilläänkin merkittävää elämänlaadullista haittaa. Väitöskirjatutkimukseni tavoitteena on löytää nopeampi menetelmä tunnistaa <i>A. castellanii</i> biologisesta näytteestä sekä löytää uusia potentiaalisia lääkeainemolekyylejä näiden kolmen loisen aiheuttamien sairauksien tehokkaammaksi hoitamiseksi.

Väitöstutkimuksessani tuotin <i>E. histolytican</i> ja <i>S. mansonin</i> β-hiilihappoanhydraasit <i>Escherichia coli</i> -bakteereissa. Tutkimme hiilihappoanhydraasien inhibiittorien vaikutusta tuotettuihin entsyymeihin, ja löysimme useita lupaavia inhibiittoreita. Lisäksi kehitimme uuden nopean diagnostisen menetelmän <i>A. castellaniin</i> havaitsemiseksi näytteestä, sillä nykyinen ameban viljelyyn perustuva menetelmä on kliiniseen diagnostiikkaan liian hidas. Nykyiset <i>A. castellaniin</i> aiheuttamien infektioiden hoitoon käytetyt lääkkeet ovat vain kohtalaisen tehokkaita ja niihin liittyy useita haittavaikutuksia, joten kehitimme uuden menetelmän uusien lääkeaineiden etsimistä varten ja testasimme useita, jo kliinisessä käytössä olevia hiilihappoanhydraasin estäjiä menetelmällämme.

Havaitsimme, että dorsolamidi ja asetatsoliamidi ovat lupaavia uusia vaihtoehtoja akantamebakeratiitin hoitamiseksi. Niiden etuna on pitkään jatkunut käyttö ihmispotilaiden muiden sairauksien hoidossa, joten niiden haitta- ja sivuvaikutukset ovat tunnettuja. Valitettavasti asetatsoliamidi on vain kohtalaisen tehokas inhiboimaan <i>E. histolytican </i>ja <i>S. mansonin</i> β-hiilihappoanhydraaseja. Dorsolamidi on tehokas inbiittori <i>S. mansonin</i> β-hiilihappoanhydraasia vastaan, toisin kuin <i>E. histolytican</i> β-hiilihappoanhydraasia se inhiboi huonosti. Onneksi moni muu inhibiittori on tehokas estämään niiden molempien toimintaa.

Tämä väitöskirja lisää tietoa ja mahdollisuuksia hyödyntää hiilihappoanhydraaseja loisinfektioiden diagnostiikassa ja hoidossa.

Carbonic anhydrases (CAs, EC 4.2.1.1) are metalloenzymes that can be found in almost all living organisms. They catalyze a vital chemical reaction: the reversible hydration of carbon dioxide (CO2 + H2O ⇋ H2CO3 ⇋ HCO3− + H+). It is part of multiple physiological and metabolic processes, such as p regulation, gluconeogenesis and photosynthesis. CAs are divided into eight families, from which the human genome only involves α-CAs. Many pathogens, such as bacteria and parasites, also have CA enzymes from other families.

<i>Schistosoma mansoni</i> is a parasitic blood fluke that causes intestinal infection in many tropical and subtropical areas. <i>Entamoeba histolytica</i> and <i>Acanthamoeba castellanii </i>are amoebae that cause different infections in humans. <i>E. histolytica</i> causes intestinal infection, and <i>A. castellanii</i> mainly infects the cornea but also causes invasive infections in immunocompromised people. The infections of these parasites are common globally, and unfortunately, the diagnosis and treatment are often delayed. The infections can be lethal, and at their mildest, they cause a significant reduction in the quality of life. My study aims to find a faster and more effective way to detect <i>A. castellanii</i> from a biological sample and discover new potential drug candidates to treat these parasitic infections.

In my thesis, I produced the β-CAs of <i>E. histolytica</i> and <i>S. mansoni</i> using <i>Escherichia coli</i> as a protein production organism. We studied the inhibitory effects of many known CA inhibitors and identified several promising candidates or potential leads for further development. In addition, we developed a novel rapid diagnostic method to detect <i>A. castellanii</i> from a biological sample. The novel method could replace the current gold standard, sample culture, which is slow in clinical diagnostics. We established a new method to investigate potential drug candidates for treating <i>A. castellanii</i>, as the current treatment options are only moderately effective and have many adverse side effects. By this method, we tested several clinically used CA inhibitors with interesting outcomes.

Dorzolamide and acetazolamide were found to be new promising options for treating Acanthamoeba keratitis. The advantage of these drugs is also the long use history with human patients in treating other conditions, which has made the side effects and risks very familiar to medical staff. Unfortunately, acetazolamide was only moderately effective against the β-CAs of <i>S. mansoni</i> and <i>E. histolytica</i>, as was dorzolamide against the β-CA of <i>E. histolytica</i>. In contrast, dorzolamide was an effective inhibitor against the β-CA of <i>S. mansoni</i>. We also found many other effective inhibitors against the β-CAs of <i>E. histolytica</i> and <i>S. mansoni</i>.

This thesis increases the knowledge and options to use the CAs of parasites to diagnose and treat infections caused by parasites.