In Vitro Maturation and Functionality Assessment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for Therapeutic Applications

Abstract

Näkökyky on ihmisen hyvinvoinnin ja elämän laadun kannalta tärkein aistimme. Näkökykyä ylläpitää verkkokalvon pigmenttiepiteeli (engl. retinal pigment epithelium, RPE), joka sijaitsee silmän takaosassa verkkokalvon ja suonikalvon välissä huolehtien erityisesti verkkokalvon näköaistinsolujen toiminnasta ja täten koko näköaistista. RPE:n toimintahäiriöt voivat johtaa verkkokalvon rappeumasairauksiin kuten ikärappeumaan, joihin liittyy heikentynyt näkökyky tai jopa sokeus. Tällä hetkellä hoitokeinot ikärappeumaan ovat varsin rajalliset. Solusiirtohoitoa, jossa vaurioituneet RPE-solut korvataan terveillä RPE-soluilla, pidetään potentiaalisena tulevaisuuden hoitokeinona verkkokalvon rappeumasairauksiin. Ihmisen alkion kantasoluista erilaistetut RPE-solut (hESC- RPE) ovat osoittautuneet lupaavaksi solulähteeksi näihin soluterapiahoitoihin. Nykyiset kliiniset kokeet ovat osoittaneet hoitojen turvallisuuden, mutta hoitojen tehokkuuden saavuttamiseksi tarvitaan vielä lisää tutkimusta sekä lisätietoa siirrettävien solujen kypsyystasojen vaikutuksesta hoitotuloksiin. Tässä väitöskirjassa keskityttiin laboratoriossa kasvatettujen hESC-RPE-solujen ominaisuuksien analysointiin kolmella eri lähestymistavalla: I) tutkittiin kasvatusalustassa käytetyn proteiinipinnoitteen vaikutusta solujen ominaisuuksiin ja RPE:lle tyypillisten proteiinien ilmentymiseen, II) tutkittiin kasvatusajan vaikutusta solujen kykyyn sietää solustressiä ja III) tutkittiin Ca2+ -kanavien ilmentymistä ja roolia hESC-RPE:ssä.

Työn tulokset voidaan tiivistää kolmeen päätulokseen. Ensinnäkin, kasvatusalustana käytettävällä proteiinipinnoitteella huomattiin olevan merkittävä rooli hESC-RPE:n ominaisuuksiin. Solujen toiminnallisuus parani ja solukerroksesta tuli tasalaatuisempi. Toiseksi, pidemmällä viljelyajalla huomattiin olevan positiivisia vaikutuksia solujen kykyyn sietää paremmin solustressiä, jolla on tärkeä merkitys esimerkiksi solusiirtohoidon onnistumisen kannalta. Kolmanneksi, tutkimustulokset myös osoittivat, että Ca2+-kanavan, erityisesti jänniteohjatun CaV1.3 alatyypin, sijainti hESC-RPE-soluissa muuttui viljelyajan pidentyessä. Lisäksi osoitimme CaV1.3- kanavan osallistuvan hESC-RPE-solujen fagosytoosiin sekä verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) erityksen säätelyyn.

Yhteenvetona tämä väitöskirja tuo merkittävästi uutta tietoa hESC-RPE-solujen ominaisuuksista, joihin pystytään vaikuttumaan viljelyolosuhteilla kasvatusalustan pinnoitteella sekä viljelyajalla. Työn tuloksia voidaan hyödyntää RPE-solututkimuksissa, mutta myös soluterapiahoidon kehityksessä.

Vision can be regarded as a critical sense in everyday life, and vision loss is associated with a deterioration in quality of life. The visual function is partly ensured by the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of pigmented cells supporting the welfare of the neural retina, which itself has many essential functions. Age-related macular degeneration (AMD) is a retinal degenerative disease where the degeneration of the RPE can lead to impaired or total loss of vision. To date, no curative treatment is available for AMD. However, replacement of the damaged and dysfunctional RPE cells with <i>in vitro</i> differentiated and cultured RPE cells is considered as a potential approach to cure AMD and other RPE degeneration- related diseases. Human embryonic stem cell-derived RPE (hESC-RPE) cells have been shown to be a promising cell source for the transplantation studies. Current clinical trials have shown no safety issues, but the efficacy of the transplantation remains to be studied in further clinical trials. One possible issue with clinical efficacy can be the immature state of the transplanted RPE cells. The work presented in this thesis focuses on the <i>in vitro</i> maturation of cryopreserved hESC-RPE cells with three approaches: I) to study the influence of the surface protein coating to the maturation of hESC-RPE cells on the functional level and in the expression of RPE-related proteins during maturation, II) to study the tolerance to cellular stress in different maturation levels of hESC-RPE cells, and III) to investigate the functional Ca2+ channels in hESC-RPE.

Based on the results obtained in this thesis, there are three main findings. First, adding more complexity to the culture substrate protein coatings is advantageous in improving the functionality of hESC-RPE cells and producing a more homogenous RPE cell layer. Secondly, a prolonged culture time was observed to have positive effects on the ability of hESC-RPE cells to tolerate cellular stress, which is important, for example, for the success of cell transplant therapy. Thirdly, the results showed that the intracellular localization of the Ca2+ channel, in particular the voltage-gated CaV1.3 subtype, changed as the culture time increased. In addition, the results indicate that the CaV1.3 channel is involved in the regulation of phagocytosis and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion.

To conclude, this thesis provides new insights into the phenotypic changes of cryopreserved hESC-RPE cells, which can be altered with culture conditions such as substrate protein coatings and culture time. Importantly, the results from this thesis can be utilized in RPE studies in general but also in the development of transplantation therapies.