Non-structural enteroviral proteins as antigens in a serodiagnostic immunoassay
Seppälä, Erika (2023)
Seppälä, Erika
2023
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan maisteriohjelma - Master's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2023-07-25
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202307247268
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202307247268
Tiivistelmä
Enteroviruses are one of the most common human pathogens. They cause diseases ranging from mild respiratory illness to severe diseases like encephalitis, pancreatitis, and myocarditis, especially among young children. They can also develop persistent infections, which have been linked to chronic immune-mediated illnesses, such as diabetes, asthma, and celiac disease. Serological diagnostics of antibodies formed after enterovirus infections is important in examining these connections. Finding the exact time of infection is challenging with serological methods, but antibodies against enteroviral non-structural proteins have previously noted to be potential markers of recent enterovirus infection. Recently, a second open reading frame (ORF2) was discovered in the enterovirus genome. It translates to a protein called ORF2p that seems to be essential in releasing new viral particles from human gut cells. Other non-structural proteins, such as 3C protease, have previously noted to have potential use as immunomarkers.
The aim of this thesis was to produce and purify two recombinant enteroviral proteins: ORF2p from Enterovirus B (CVB1) and 3C protease from Rhinovirus C (RV-C3) and use them as antigens in a serodiagnostic multiplex immunoassay with a panel of other enteroviral antigens to test their diagnostic value. The proteins were produced in Escherichia coli cultures and purified using two sequential affinity chromatography steps: Glutathione-s-transferase (GST) purification and immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) with poly histidine affinity tags. Commercial U-PLEX® assay platform from Meso Scale Diagnostics (MSD) was used to measure antibody levels from serum samples. This assay method utilizes the strong affinity of biotin and the protein avidin, for which the antigens were biotinylated during the purification process.
The aim of this thesis was achieved. Both ORF2p and 3C were successfully produced and purified. They both had antibodies binding to them when first tested with pooled adult sera. The proteins were added to a panel of other enterovirus antigens which was used to run a characterized sample set of child sera that was retrieved from a birth cohort study. Antibody levels as a function of age for individual children were outlined according to the multiplex assay results. These timelines showed the expected initial decrease of maternal antibodies until around six months of age and their gradual rise and possible decreases as the immune system developed. The results supported earlier observations of cross-reactive antibody proportion against VP1 proteins increasing with age and indicated 3C cross-reactivity. The results indicate potential further use of these antigens in studying pathogen-disease connections, which is important in preventing chronic immune-mediated diseases, however, further studies should be conducted. Enterovirukset ovat yksiä yleisimmistä ihmisen taudinaiheuttajista. Ne aiheuttavat tauteja, jotka vaihtelevat lievistä hengitystiesairauksista vakaviin sairauksiin, kuten enkefaliittiin, haimatulehdukseen ja sydänlihastulehdukseen. Vakavia oireita esiintyy erityisesti pienillä lapsilla. Enterovirukset voivat myös aiheuttaa pitkään jatkuvia infektioita, jotka ovat yhdistetty kroonisiin immuunivälitteisiin sairauksiin, kuten diabetekseen, astmaan ja keliakiaan. Enterovirusinfektioiden jälkeen muodostuvien vasta-aineiden serologinen diagnostiikka on tärkeää näiden yhteyksien tutkimisessa. Tartunnan tarkan ajankohdan tunnistaminen serologisilla menetelmillä on haastavaa, mutta enterovirusten ei-rakenteellisten proteiinien vasta-aineiden on aiemmin todettu olevan mahdollisia merkkiaineita äskettäisten infektioiden tunnistamisessa. Äskettäin enteroviruksen genomista tunnistettiin toinen avoin lukukehys. Se transloituu proteiiniksi nimeltä ORF2p, joka vaikuttaa olevan välttämätön uusien viruspartikkeleiden vapauttamisessa ihmisen suolistosoluista. Muilla ei-strukturaalisilla proteiineilla, kuten 3C-proteaasilla, on jo aiemmin huomattu olevan potentiaalia immunomarkkereina.
Tämän diplomityön tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa kahta rekombinanttia enterovirusproteiinia: ORF2p:tä Enterovirus B:stä (CVB1) ja 3C-proteaasia Rinovirus C:stä (RV-C3) ja käyttää niitä antigeeneina serodiagnostisessa multiplex-vasta-ainemääristyksessä yhdessä muiden enterovirusantigeenien kanssa näiden proteiinien mahdollisen diagnostisen arvon tutkimiseksi. Proteiinit tuotettiin Escherichia coli -viljelmissä ja puhdistettiin käyttämällä kaksivaiheista affiniteettikromatografiapuhdistusta: Glutathioni-S-transferaasipuhdistusta (GST) ja immobilisoitua metalli-ioniaffiniteettikromatografiaa (IMAC) polyhistidiinipuhdistuskahvojen avulla. Meso Scale Diagnosticsin (MSD) kaupallista U-PLEX® -määritysalustaa käytettiin vasta-ainetasojen mittaamiseen seeruminäytteistä. Tässä määritysmenetelmässä hyödynnetään biotiinin ja avidiiniproteiinin vahvaa affiniteettia, minkä vuoksi antigeenit biotinyloitiin puhdistusprosessin yhteydessä.
Tämän diplomityön tavoite saavutettiin. Sekä ORF2p että 3C tuottuivat ja puhdistuivat onnistuneesti. Niitä molempia vastaan muodostui vasta-aineita, jotka sitoutuivat niihin ajettaessa vasta-ainetestejä yhdistetyillä aikuisten seeruminäytteillä. Nämä proteiinit lisättiin muista enterovirusantigeeneista koostuvaan paneeliin, jota käytettiin syntymäkohorttitutkimuksesta saadun karakterisoidun lapsiseeruminäytesarjan vasta-ainemäärityksessä. Yksittäisten lasten vasta-ainetasot iän funktiona piirrettiin tulosten perusteella. Nämä aikajanat osoittivat odotetusti äidin vasta-ainetasojen vähenemisen noin kuuden kuukauden ikään asti ja niiden asteittaisen nousun ja mahdollisen laskun immuunijärjestelmän kehittyessä. Tulokset tukivat myös aikaisempia havaintoja ristiinreagoivien vasta-aineiden keskittymisestä VP1-proteiineja vastaan ikääntymisen myötä sekä antoivat viitteitä 3C-vasta-aineiden ristiinreagoivuudesta. Tulokset antavat viitteitä näiden antigeenien mahdolliseen jatkokäyttöön patogeenien ja tautien välisten yhteyksien tutkimisessa, mikä on tärkeää kroonisten immuunivälitteisten sairauksien ehkäisyssä. Lisätutkimuksia aiheesta tulisi kuitenkin tehdä.
The aim of this thesis was to produce and purify two recombinant enteroviral proteins: ORF2p from Enterovirus B (CVB1) and 3C protease from Rhinovirus C (RV-C3) and use them as antigens in a serodiagnostic multiplex immunoassay with a panel of other enteroviral antigens to test their diagnostic value. The proteins were produced in Escherichia coli cultures and purified using two sequential affinity chromatography steps: Glutathione-s-transferase (GST) purification and immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) with poly histidine affinity tags. Commercial U-PLEX® assay platform from Meso Scale Diagnostics (MSD) was used to measure antibody levels from serum samples. This assay method utilizes the strong affinity of biotin and the protein avidin, for which the antigens were biotinylated during the purification process.
The aim of this thesis was achieved. Both ORF2p and 3C were successfully produced and purified. They both had antibodies binding to them when first tested with pooled adult sera. The proteins were added to a panel of other enterovirus antigens which was used to run a characterized sample set of child sera that was retrieved from a birth cohort study. Antibody levels as a function of age for individual children were outlined according to the multiplex assay results. These timelines showed the expected initial decrease of maternal antibodies until around six months of age and their gradual rise and possible decreases as the immune system developed. The results supported earlier observations of cross-reactive antibody proportion against VP1 proteins increasing with age and indicated 3C cross-reactivity. The results indicate potential further use of these antigens in studying pathogen-disease connections, which is important in preventing chronic immune-mediated diseases, however, further studies should be conducted.
Tämän diplomityön tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa kahta rekombinanttia enterovirusproteiinia: ORF2p:tä Enterovirus B:stä (CVB1) ja 3C-proteaasia Rinovirus C:stä (RV-C3) ja käyttää niitä antigeeneina serodiagnostisessa multiplex-vasta-ainemääristyksessä yhdessä muiden enterovirusantigeenien kanssa näiden proteiinien mahdollisen diagnostisen arvon tutkimiseksi. Proteiinit tuotettiin Escherichia coli -viljelmissä ja puhdistettiin käyttämällä kaksivaiheista affiniteettikromatografiapuhdistusta: Glutathioni-S-transferaasipuhdistusta (GST) ja immobilisoitua metalli-ioniaffiniteettikromatografiaa (IMAC) polyhistidiinipuhdistuskahvojen avulla. Meso Scale Diagnosticsin (MSD) kaupallista U-PLEX® -määritysalustaa käytettiin vasta-ainetasojen mittaamiseen seeruminäytteistä. Tässä määritysmenetelmässä hyödynnetään biotiinin ja avidiiniproteiinin vahvaa affiniteettia, minkä vuoksi antigeenit biotinyloitiin puhdistusprosessin yhteydessä.
Tämän diplomityön tavoite saavutettiin. Sekä ORF2p että 3C tuottuivat ja puhdistuivat onnistuneesti. Niitä molempia vastaan muodostui vasta-aineita, jotka sitoutuivat niihin ajettaessa vasta-ainetestejä yhdistetyillä aikuisten seeruminäytteillä. Nämä proteiinit lisättiin muista enterovirusantigeeneista koostuvaan paneeliin, jota käytettiin syntymäkohorttitutkimuksesta saadun karakterisoidun lapsiseeruminäytesarjan vasta-ainemäärityksessä. Yksittäisten lasten vasta-ainetasot iän funktiona piirrettiin tulosten perusteella. Nämä aikajanat osoittivat odotetusti äidin vasta-ainetasojen vähenemisen noin kuuden kuukauden ikään asti ja niiden asteittaisen nousun ja mahdollisen laskun immuunijärjestelmän kehittyessä. Tulokset tukivat myös aikaisempia havaintoja ristiinreagoivien vasta-aineiden keskittymisestä VP1-proteiineja vastaan ikääntymisen myötä sekä antoivat viitteitä 3C-vasta-aineiden ristiinreagoivuudesta. Tulokset antavat viitteitä näiden antigeenien mahdolliseen jatkokäyttöön patogeenien ja tautien välisten yhteyksien tutkimisessa, mikä on tärkeää kroonisten immuunivälitteisten sairauksien ehkäisyssä. Lisätutkimuksia aiheesta tulisi kuitenkin tehdä.