Enterovirusten tyypitys molekyylibiologisilla menetelmillä jätevedestä : haasteet PCR-monistuksen sensitiivisyyden ja spesifisyyden saavuttamisessa

Abstract

Enterovirukset ovat helposti tarttuvia ja yleisiä taudinaiheuttajia. Ne aiheuttavat virustyypistä riippuen erilaisia sairauksia. Yleisimmin infektiot ovat vähäoireisia tai oireettomia, mutta ne voivat aiheuttaa myös vakavampia sairauksia, kuten sydänlihas- ja aivokalvontulehdusta, enterorokkoa sekä neurologisia oireita. Enterovirusten tarkka tyypitys, eli lajin alaluokan määritys, on tärkeää, kun halutaan tutkia esimerkiksi eri virustyyppien yhteyttä eri sairauksiin, virulenssitekijöitä tai enterovirusten epidemiologiaa.

Enterovirusten luokittelu on päivittynyt geneettisen tiedon lisäännyttyä molekyylibiologisten tyypitysmenetelmien kehittymisen myötä. Molekyylibiologista menetelmistä käytetympiä ovat uuden sukupolven sekvensointimenetelmät. Nämä menetelmät vaativat kohdesekvenssin monistamista PCR menetelmillä. Haasteena näissä menetelmissä on saavuttaa niissä vaadittava spesifisyys ja sensitiivisyys. Spesifillä menetelmällä pystytään maksimoimaan todellisten positiivisten määrä. Sensitiivisellä menetelmällä voidaan puolestaan minimoida väärien positiivisten tulosten määrä.

Työssä tarkastellaan enterovirusten tyypittämistä molekyylibiologisilla menetelmillä kirjallisuuden sekä kokeellisen työn kautta. Tarkemmin tarkasteltiin mistä haasteet PCR-monistuksessa johtuvat, mitkä tekijät vaikuttavat PCR-monistuksen sensitiivisyyteen ja spesifisyyteen sekä miten näihin haasteisiin voidaan vastata. Kokeellisen työn tavoitteena oli kehittää sisäkkäiseen PCR-monistukseen pohjautuva menetelmä, jonka avulla enteroviruksia voidaan tyypittää jätevesinäytteistä. Työssä tarkasteltiin myös jätevesinäytteiden ominaisuuksia sekä niiden tuomia haasteita. Enterovirusten tyypitys jätevesistä mahdollistaa mm. patogeenien esiintymisen seurannan sekä tautitaakan kartoittamisen väestötasolla.

Kirjallisuuden avulla saatiin selville, että PCR-menetelmän spesifisyyteen ja sensitiivisyyteen vaikuttavat tekijät eivät rajoitu vain PCR-monistuksessa käytettäviin reagensseihin ja olosuhteisiin. PCR:ssä käytettävän näytteen ominaisuuksilla ja PCR:ää edeltävillä vaiheilla on suuri vaikutus. Kokeellisessa osiossa menetelmä saatiin kehitettyä onnistuneesti ja se soveltuu käytettäväksi tulevaisuudessa enterovirusten tyypitykseen jätevesinäytteistä.

Enteroviruses are highly contagious and common pathogens. The cause a variety of different symptoms and diseased depending on the virus type. Most commonly, infections caused by enteroviruses are mild or asymptomatic, but they can also cause more severe diseased such as meningitis, myocarditis, hand, foot and mouth disease and neurological symptoms. Accurate typing methods for enteroviruses, i.e. subtyping of species, are needed when studying topics such as the association of different virus types with different diseases, virulence factors or the epidemiology of enteroviruses.

The classification of enteroviruses has been updated due to the increased genetic information and the development of molecular biological typing methods. Among the molecular biological methods, the next generation sequencing methods are the most widely used. These methods require amplification of the target sequence by PCR. The challenge to achieve the required specificity and sensitivity for PCR amplification. A sensitive method can maximize the number of true positives and a sensitive method to minimize the number of false positives.

This thesis examines typing of enteroviruses by molecular biological methods through both by literature and experimental work. The focus is on the challenges of PCR amplification, the factors affecting sensitivity and specificity and how these challenges can be addressed. The aim of the experimental was to develop a method based on nested PCR for enterovirus typing from wastewater samples. The characteristics of wastewater samples and the challenges they present were also examined. Enterovirus typing from wastewater allows monitoring of pathogen prevalence and mapping current disease burden at the population level among other things.

The literature review showed that the factors affecting the specificity and sensitivity of the PCR method are not limited only to the reagents and conditions used in PCR amplification. The characteristics and steps preceding the PCR amplification have major impact. In the experimental part, the method was successfully developed and is suitable for future use in typing of enteroviruses from wastewater samples.