Bacteria-targeting virus-like particle vaccine candidates in prevention of thrombosis

Abstract

Thrombosis, the world’s leading cause of death, causes major cardiovascular complications, such as myocardial infarction and stroke. Although unhealthy lifestyle, such as smoking and high-fat diet and high levels of LDL-cholesterol in blood have an undisputed role in cardiovascular diseases, infections are also associated with thrombotic events. In addition, several commensal bacterial genera have been detected in thrombus aspirates of patients with cardiovascular complications by using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and immunohistochemistry. The aim of this thesis was to develop a vaccine against oral bacteria to prevent bacterial-induced thrombosis.

Three bacteria-targeting virus-like particle (VLP) vaccine candidates were made utilizing the SpyTag/SpyCatcher technology. VLPs have similar size and structure to native viruses but do not contain genetic material. In this study, readily available norovirus-like particles (noro-VLPs) were used as a vaccine platform. Bacterial antigens containing genetically fused SpyCatcher-linkers were produced in Escherichia coli and purified using His-tag affinity and size-exclusion chromatography. SpyTag-linked noro-VLPs and SpyCatcher-linked antigens were conjugated together by a spontaneous isopeptide reaction, decorating the surface of noro-VLPs with antigens. Protein purity and conjugation efficiency were estimated using SDS-PAGE and densitometry analysis, respectively, whereas commercial kit was used for the quantification of endotoxin levels.

Two out of three (2/3) bacterial antigens were produced with adequate quantity (14-32 mg) and the conjugation efficiency between the SpyCatcher-antigens and the SpyTag-noro-VLPs was estimated to be approximately 78%. The quantity (0.2 mg) and conjugation efficiency (~19%) were lower for the third antigen. However, all antigens were produced with adequate purity and their endotoxin levels (<20 endotoxin unit/mL) were acceptable for preclinical studies.

Overall, the production of vaccine candidates was successful. Their immunogenicity and the antithrombotic effect will be investigated in future studies. Eventually this may lead to novel bacteria-targeting virus-like particle -based vaccine against thrombosis with a significant societal impact. This study can also provide new insights about the role of bacteria in thrombosis.

Tromboosi, maailman yleisin kuolinsyy, aiheuttaa merkittäviä sydän- ja verisuonisairauksien komplikaatioita, joista esimerkkejä ovat sydäninfarkti ja aivohalvaus. Vaikka epäterveellisillä elintavoilla, kuten tupakoinnilla ja runsasrasvaisella ruokavaliolla sekä veren korkeilla LDL-kolesterolipitoisuuksilla on kiistaton merkitys sydän- ja verisuonisairauksissa, ovat myös infektiot yhteydessä tromboottisiin tapahtumiin. Lisäksi useita kommensaalibakteerilajeja on havaittu sydän- ja verisuonitautikomplikaatioista kärsivien potilaiden trombinäytteistä käyttäen kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota ja immunohistokemiallisia menetelmiä. Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää rokote suun bakteereja vastaan bakteerien indusoiman tromboosin ehkäisemiseksi.

Kolme bakteeriin kohdistuvaa, viruksen kaltaisiin partikkeleihin perustuvaa rokotekandidaattia tuotettiin hyödyntämällä SpyTag/SpyCatcher teknologiaa. Viruksen kaltaiset partikkelit ovat kooltaan ja rakenteeltaan samankaltaisia kuin alkuperäiset virukset, mutta ne eivät sisällä geneettistä materiaalia. Tässä tutkimuksessa rokotealustana käytettiin valmiiksi saatavilla olleita noroviruksen kaltaisia partikkeleita. Geneettisesti fuusioituja SpyCatcher-linkkereitä sisältäviä bakteeriantigeeneja tuotettiin Escherichia coli -bakteerissa ja ne puhdistettiin käyttämällä His-tag affiniteettikromatografiaa ja geelisuodatuskromatografiaa. SpyTag-linkattu noroviruksen kaltainen partikkeli ja SpyCatcher-linkattu antigeeni konjugoituivat yhteen spontaanilla isopeptidisidoksella, jolloin noroviruksen kaltaisen partikkelin pinta saatiin päällystettyä antigeeneilla. Proteiinien puhtaus ja konjugaatiotehokkuus arvioitiin SDS-PAGE:n ja densitometrianalyysin avulla, kun taas endotoksiinitasot määritettiin kaupallista kittiä käyttäen.

Kaksi kolmesta (2/3) bakteeriantigeenista tuotettiin riittävällä määrällä (14–32 mg), ja konjugaatiotehokkuus SpyCatcher-linkattujen antigeenien ja SpyTag-linkattujen noroviruksen kaltaisten partikkelien välillä arvioitiin olevan n. 78 %. Kolmannen antigeenin määrä (0.2 mg) ja konjugaatiotehokkuus (n. 19 %) olivat alhaisemmat. Kaikki antigeenit saatiin kuitenkin tuotettua riittävällä puhtaudella ja niiden endotoksiinipitoisuudet (<20 endotoksiiniyksikköä/mL) ovat hyväksyttäviä prekliinisiin tutkimuksiin.

Kaiken kaikkiaan rokotekandidaattien tuotanto onnistui hyvin. Niiden immunogeenisyyttä ja antitromboottista vaikutusta tutkitaan tulevissa tutkimuksissa. Lopulta tämä voi johtaa uusiin bakteereihin kohdistuviin, viruksen kaltaisiin partikkeleihin perustuviin rokotteisiin tromboosia vastaan, millä olisi merkittävä yhteiskunnallinen vaikutus. Tämä tutkimus voi myös antaa uusia oivalluksia bakteerien roolista tromboosissa.