Functionality and morphology of iPSC-derived cardiomyocytes in multicellular 3D cardiovascular construct

Abstract

Cardiovascular diseases are major death leading cause in the world, and with aging people the socio-economic burden caused by these diseases exponentially grows. In addition, cardiotoxicity is most common reason behind drug withdrawal from the market, as toxicity is usually detected after longer clinical use. Animal models can’t truthfully recapitulate human pathophysiology, therefore the results obtained are not often accurate. Also, they are hampered by ethical issues. There is unmet need for in vitro models of human heart , that could be used for modeling cardiovascular diseases, for drug development and for cardiotoxicity screening. The main aim of this work is to create functional multicellular three-dimensional model of human myocardium, that could be used for modeling cardiovascular diseases. The project is part of Center of Excellence in Body-on-Chip research.

In this project, induced pluripotent stem cells -derived cardiomyocytes (iPSC-CM) were cultured together with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human adipose stem cells (hASCs) to form 3D cardiovascular construct, supported with gelatin-gellan gum hydrogel. HUVECs and hASCs formed vascular structures in the model, as well as were supporting iPSC- CMs maturation, functionality, and viability in the construct. Additionally, also construct composed of hASCs and iPSC-CMs was built, to see if hASCs could be used alone as supportive cell type in co-culture. Cells were co-cultured together for 9 days, in two different culture mediums. During the co-culture, iPSC-CMs beating was video imaged in two separate days, to investigate if there were any changes in cells function in different environments. CellVisus software was used to transform the data into quantitative form. In addition, cells were characterized with immunocytochemical staining and confocal imaging.

The results showed that iPSC-CMs were functional and viable in the co-culture. The used culture media did not have effect on the cells’ viability, nor function. However, the beating frequency was higher in co-culture and iPSC-CMs showed transformed and more mature morphology. The shape was more elongated, iPSC-CMs were aligned and attached to each other, and organized and elongated sarcomere structures could be seen in co-culture. In addition, similar results were gotten from hASCs and iPSC-CMs co-culture, showing that hASCs function well as supporting cells in the construct.

Cardiomyocytes showed typical characteristics when cultured in 3D environment together with HUVECs and hASCs, thus this model provide potential platform for cardiovascular disease research and development in the future.

Maailmanlaajuisesti sydänsairaudet ovat yksittäinen suurin kuolemaan johtava ryhmä sairauksia. Väestön ikääntyessä, terveydenhuollon taakka kasvaa. Kardiotoksisuus on yleisin syy lääkkeiden poisvetämiseen markkinoilta, sillä lääkeaineen kardiotoksisuus usein havaitaan vasta kliinisessä käytössä pidemmän ajan jälkeen. Eläinmallit eivät totuudenmukaisesti kuvaa ihmisen fysiologiaa, ja eläinkokeista saadut tulokset ovat usein epätarkkoja. Lisäksi niitä varjostavat eettiset ongelmat. Tarve ihmisen sydänkudosta mallintaville kudosmalleille on suuri, jotta kardiovaskulaarisia sairauksia ja niiden mekanismeja voidaan luotettavasti tutkia. Kudosmalleja tarvitaan myös lääkekehityksen tarpeisiin, seulomaan potentiaalisia yhdisteitä prekliinisissä vaiheissa, nopeuttamaan lääkkeiden kehitystä ja vapautusta markkinoille. Tämän työn tarkoituksena on kehittää toiminnallinen, eri solutyypeistä koostuva, kolmiulotteinen malli jäljittelemään ihmisen sydänlihaskudosta, jota voitaisiin hyödyntää sydänsairauksien mallintamiseen. Työ on toteutettu osana Monikudosmallintamisen Huippuyksikön tutkimusta.

Tässä työssä, indusoiduista pluripotenteista kantasoluista erilaistettuja kardiomyosyyttejä viljeltiin yhdessä ihmisen napanuoran laskimosta peräisin olevien endoteelisolujen, sekä rasvakudoksesta peräisin olevien kantasolujen kanssa, tavoitteena luoda kolmiulotteinen malli sydänlihaskudoksesta. Kolmiulotteinen ympäristö luotiin gelatiinista ja gellaanikumista peräisin olevaan hydrogeeliin. Endoteelisolujen ja rasvakudoksen kantasolujen tarkoitus yhteisviljelmässä on muodostaa verisuonimaisia rakenteita, ja tukea kardiomyosyyttien toiminnallisuutta ja kypsymistä. Kardiomyosyyttejä viljeltiin lisäksi myös pelkkien rasvan kantasolujen kanssa, jotta kantasolujen potentiaalia tukisoluina voitiin tutkia. Endoteelisolut, rasvakudoksen kantasolut sekä kardiomyosyytit olivat yhteisviljelmässä 9 päivää. Soluja viljeltiin kahdessa erityyppisessä kasvatusliuoksessa. Tänä aikana kardiomyosyyttien sykintää videoitiin kahtena erillisenä päivänä, jotta toiminnallisuutta eri ympäristöissä voitaisiin laskennallisesti tutkia. Videot prosessoitiin CellVisus ohjelmistolla. Lisäksi suoritettiin immunosytokemialliset värjäykset, ja soluja kuvattiin konfokaalisella mikroskoopilla rakenteiden tutkimiseksi.

Tulokset osoittivat, että kardiomyosyytit ovat eläviä ja toiminnallisia yhteisviljelmässä. Eri mediumien välillä ei havaittu eroja solujen elävyydessä tai toiminnassa. Sykintä oli voimakkaampaa yhteisviljelmissä, ja konfokaalikuvantaminen osoitti kardiomyosyyttien muuttunutta ja kypsynyttä rakennetta. Muoto oli pidentynyt, solut olivat linjautuneet ja kiinnittyneet toistensa kanssa, sekä järjestäytyneitä ja linjautuneita sarkomeerirakenteita voitiin havaita kardiomyosyyteissä yhteisviljelmässä. Samankaltaisia tuloksia saatiin myös yhteisviljelmästä, jossa oli vain rasvakudoksen kantasoluja sekä kardiomyosyyttejä. Rasvakudoksen kantasolut toimivat yksinään hyvin tukisoluina kardiomyosyyteille.

Kardiomyosyytit osoittivat niille tyypillisiä ominaisuuksia yhteisviljelmässä kolmiulotteisessa ympäristössä. Sydänkudosmallia voitaisiinkin mahdollisesti hyödyntää tulevaisuudessa alustana erilaisten sydänsairauksien tutkimiseen, ja lääkkeiden kehitykseen.